第四章 目的基因的分离 2

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1、二、利用PCR扩增目的基因1.巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是指利用两对PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少）增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检测的可靠性。2.反向PCR(InversePCR)用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定

2、插入失活基因或体内诱导基因已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图3.不对称PCR(asymmetricPCR)引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。产生的单链DNA主要用于DNA测序。高浓度引物低浓度引物4.锚定PCR(anchoredPCR)通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端

3、序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（PolyG）的尾巴，然后分别用多聚dC(PolyC)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制酶识别位点polydC)一起作PCR扩

4、增cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------T

5、TTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增5.长程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)选用TaKaRa的LATaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶。具有3’→5’校对功能，可信度高。扩增长度长。逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6.逆转录PCR(RT-PCR)RT-PCRRT-PCR7.AluPCRAlu序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个Alu序列间隔约4kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR称为AluP

6、CR。设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不

7、破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。差示PCR,differentialPCR,d-PCRd-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5’端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。现在的PCR定量方法