pfos对神经细胞bdnftrkbcreb信号通路的影响

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PFOS对神经细胞BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响摘要：全氟辛烷磺酸盐(Perfluorooctanesulfonate,PFOS)是目前应用最广泛、使用量最大的一种全氟有机化合物。研究表明，PFOS除了能够引起肝脏、心脏、肺脏、生殖、免疫等多器官多系统毒性外，还能诱发神经毒性。由于PFOS能通过胎盘屏障和血脑屏障，故其神经发育毒性备受关注。本研究采用昆明种母鼠围产期PFOS暴露，建立PFOS的发育毒性模型，HE染色观察PFOS暴露对仔鼠海马和皮层的影响，QPCR检测BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因的表达。结果表明，PFOS暴露损伤海马组织，造成海马组织中空泡的出现，同时降低了BDNF、TrkB、CREB以及突触相关蛋白Syn1和Syp的mRNA水平。除此之外，本实验还采用PFOS处理SH-SY5Y细胞，建立PFOS的体外毒性模型，结果表明，PFOS能抑制SH-SY5Y细胞的增殖，降低BDNF、TrkB、CREB的表达，这与体内研究的结果一致。因此，推测PFOS能干扰神经细胞的BDNF/TrkB/CREB信号通路，这可能是PFOS神经毒性的机制之一。研究一：围产期PFOS暴露对仔鼠海马BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响目的：观察围产期PFOS暴露对仔鼠海马BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因表达的影响，探讨PFOS的神经发育毒性机制。方法：24只昆明小鼠随机分为0、0.1、1.0及5.0mg/kg/dPFOS处理组,从GD2-PND21灌胃染毒。PND21天处死仔鼠，收集脑组织，按要求处理样本。HE染色观察脑组织常规病理情况，QPCR检测海马组织BDNF、TrkB、CREB、Syn1及Syp的mRNA含量；结果：PFOS暴露造成了仔鼠海马组织出现空泡，降低了海马中BDNF、TrkB、CREBI 以及突触相关蛋白Syn1和Spy的mRNA水平；结论：PFOS干扰BDNF/TrkB/CREB信号通路，降低突触相关蛋白可能是其神经发育毒性机制之一。关键词全氟辛烷磺酸盐；神经发育毒性；BDNF/TrkB/CREB信号通路研究二：PFOS暴露对SH-SY5Y细胞BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响目的：观察PFOS暴露对SH-SY5Y细胞损伤和BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因表达的影响，探讨PFOS神经毒性机制。方法：不同浓度PFOS(0、10、50、100、150、200μM)处理SH-SY5Y细胞48h，构建PFOS的体外毒性模型，MTT法检测细胞活力，ELISA法检测细胞中BDNF蛋白含量，QPCR法检测BDNFmRNA水平，Westrenblot法检测TrkB、CREB、p-CREB的蛋白水平。结果：PFOS暴露引起SH-SY5Y细胞存活率随染毒剂量的增加而降低，与对照组相比，在50-100μM处理组有统计学意义(P＜0.05)并抑制了细胞中BDNF、TrkB、CREB表达水平，但促进了CREB磷酸化水平。结论：PFOS暴露能损伤SH-SY5Y细胞，并改变BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因表达。关键词全氟辛烷磺酸盐；神经毒性；BDNF/TrkB/CREB信号通路本课题受以下基金项目资助：国家自然科学基金（No.81273026）、湖南省自然科学基金（No.12JJ3098）II THEEFFECTOFPFOSONTHEBDNF/TrkB/CREBSIGNUALINGPATHWAYINNERVECELLSPostgraduate:ShiBoSun(PublicHealthandPreventiveMedicine)DirectedbyHuaicaiZengAbstract:Perfluorooctanesulfonate(PFOS)isaperflouorinatedcompounds(PFCs),whichiswidelydistributedintheenvironment.PreviousstudiesindicatedthatPFOScouldresultintoxicityofliver,heart,hung,andimmunitysystem,etc.SincePFOScanpassthroughtheplacentalbarrierandbrainbloodbarrier,thedevelopmentalneurotoxicityofPFOShasbeenattractedmoreattention.PregnantKunmingmiceswereexposedtoPFOStoestablishamodleofdevelopmentaltoxicityofPFOS.HEstainingwasusedtoobservetheeffectsofPFOSonhippcampusandcortexofneonatalmices.QPCRwasappliedtodetectthekeygenesmRNAlevelsoftheBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayinoffspring’shippocampus.TheresultsshowedthatPFOSexposuredamagethehippocampaltissue,resultingincavitationbubbleappearanceinthehippocampus,anddecreasedthemRNAlevelsofBDNF,TrkBandCREBaswellassynapticassociatedproteinsSyn1andSyp.Inaddition,theSH-SY5YcellsweretreatedbyPFOStoestablishavitromodelofPFOStoxicity.TheresultsindicatedthatPFOScouldinhibittheproliferationofSH-SY5Ycells,decreasedthemRNAlevelsofBDNF,anddecreasedtheproteinlevelsofBDNF,TrkBandCREB,whichwereconsistentwiththeresultsofthevivostudy.Inconclusion,PFOScoulddamagetheBDNF/TrkB/CREBsignalingIII pathwaysinnervecells,whichmaybeamechanismofneurotoxicityofPFOS.Part1:EffectofprenatalexposuretoperfluorooctanesulfonateonBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayinmiceoffspring’shippocampusObjective:TheaimistostudythedevelopmentalneurotoxicityofPFOSanditsmechanisms.Methods:PregnantKunmingmiceswereadministrated0.1,1.0and5.0mg/kg/dayPFOSbygavagefromgestationday(GD)2topostnatalday(PND)21,controlgroupreceived0.05%Tween-20.Theoffspring’sbraintissuewerecollectedandobservedbyHEstainingonthePND21.QPCRwasusedtodetectmRNAlevelofBDNF,TrkB,CREB,Syn1andSypintheoffspring’shippocampus.Result:Vacuolewasobservedinoffspring’shippocampustissueonPND21in5.0mg/kg/dPFOSgroup.Comparedwithcontrolgroup,themRNAlevelsofBDNF,TrkBandCREBweresignificantlydecreasedin5.0mg/kgPFOSgroup.ThemRNAlevelsofSyn1andSypin1.0and5.0mg/kg/dPFOSgroupweresignificantlylowerthaninthecontrolgroup.Conclusions:PFOSexposurecoulddecreasetheexpressionofBDNF,TrkB,CREB,Syn1andSyp,whichmayplayanimportantroleinthedevelopmentalneruotoxicityofPFOS.Keywords:PFOSDevelopmentalNeurotoxicityBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayIV Part2:TheeffectofperfluorooctanesulfonateonBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayinSH-SY5YcellsObjective:Theaimistoinvestigatethedamageeffectofperfluorooctanesulfonat(PFOS)andthegeneexpressionchangesofBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayonSH-SY5Ycells,andtoexplorethemechanismsofneurotoxicityofPFOS.Methods:SH-SY5Ycellsweredividedintofourgroups:controlgroup,10μMPFOSgroup,50μMPFOSgroup,100μMPFOSgroup,150μMPFOSgroupand200μMPFOSgroup.ThecellsweretreatedwithPFOS48h,andthencellactivitywasdeterminedwithMTTassay.ThemRNAorproteinexpressionofBDNFweredetectedbyQPCRorELISA,respectively.WesternblotwasusedtodetermineproteinlevelsofTrkB,CREBandp-CREB.Result:WiththeinceraseofPFOScomcentration,thesurvivalrateofSH-SY5Ycellsdecreasedincreasingly.Thedifferencebetweentheexperimentalgroups(50μM,100μMPFOS)andcontrolgroupwassignificant(P<0.05).PFOSinhibitedtheexpressionofBDNF,TrkBandCREB,butincreasedthep-CREB.Conclusion:PFOSexposuredecreasedthecellsactivityandchangedthekeygeneexpressionofBDNF/TrkB/CREBsignalingpathway.ThismightbetheoneofthemechanismsofPFOSneurotoxicology.Keywords:PFOSNeurotoxicityBDNF/TrkB/CREBsignalingpathwayV 目录摘要.............................................................................................................IAbstract.....................................................................................................Ⅲ第1章前言...........................................................................................1第2章围产期PFOS暴露对仔鼠海马BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响.............................................................................................................52.1实验材料...........................................................................................52.2实验方法...........................................................................................72.2.1动物饲养与处理.........................................................................72.2.2实验动物生长发育情况的观察.................................................72.2.3实验动物样本的收集.................................................................72.2.4HE染色......................................................................................72.2.5动物组织RNA的提取..............................................................82.2.6RNA浓度及完整性的检测.......................................................82.2.7cDNA的合成.............................................................................92.2.8QPCR..........................................................................................92.3统计分析.........................................................................................112.4结果.................................................................................................112.4.1围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠存活率的影响.........112.4.2围产期PFOS暴露对出生后幼鼠体重的影响.......................112.4.3围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠脑组织病理形态的影响.........................................................................................................112.4.4围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA表达的影响............................................................13VII 2.4.5围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织Syp、Syn1mRNA表达的影响............................................................................132.5讨论.................................................................................................142.6小结.................................................................................................16第3章PFOS暴露对SH-SY5Y细胞BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响...............................................................................................................173.1实验材料.........................................................................................173.2实验方法.........................................................................................193.2.1主要试剂的配置.......................................................................193.2.2细胞培养...................................................................................203.2.3MTT检测细胞活力.................................................................213.2.4细胞RNA的提取....................................................................213.2.5RNA浓度及完整性的检测.....................................................213.2.6cDNA的合成...........................................................................223.2.7QPCR........................................................................................233.2.8酶联免疫分析法检测BDNF基因的蛋白表达水平..............243.2.9Westernblot检测蛋白表达.....................................................253.3统计分析.........................................................................................273.4结果.................................................................................................273.4.1PFOS对SH-SY5Y细胞存活率的影响..................................273.4.2PFOS对SH-SY5Y细胞形态的影响......................................283.4.3PFOS对SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响.........................293.4.4PFOS对SH-SY5Y细胞TrkB与CREB蛋白表达的影响...293.5讨论.................................................................................................313.6小结.................................................................................................32VIII 第4章结论.............................................................................................33参考文献...................................................................................................35文献综述...................................................................................................43主要英文缩略语（按英文字母排序）..................................................55作者攻读学位期间的科研成果..............................................................56致谢...........................................................................................................57IX 第1章前言全氟辛烷磺酸盐(Perfluorooctanesulfonate,PFOS)是全氟化合物(Perfluorinatedchemicals,PFCs)的代表物质之一，也是多种全氟化合物的降解产物，1951年由美国3M公司最先研制。它的分子式为C8F17SO3H，分子量是499.93，其分子是17个氟原子及8个碳原子所构成的烃链，烃链的末端带有一个磺酸基团，烃链上的C-F共价键稳定且键能高，这使得PFOS具有极好的物理及化学稳定性(结构如图1.1)。文献报道，PFOS在浓硝酸中煮沸以及微生物条件下均不见[1]分解，仅在高温焚烧时发生裂解。同时PFOS有较高疏油疏水性，被广泛应用于泡沫灭火剂、润滑剂、农药、装饰涂料、包装、纺织品、皮革及造纸等诸多行[2]业中。图1.1PFOS的化学结构式[3]Paul等分析发现，1970年至3M公司宣布停产PFOS有关化合物，它在全球的产量约为96000吨，而直接及间接排放量约达45250吨。PFOS的大量使用致使[4]其广泛存在于全球生态系统中，造成了环境污染。研究发现，它不仅在水体、[2][5]土壤、空气和食品中存在，也存在于野生动物和人类体内；其暴露不仅发生在职业人群中，也发生于非职业人群，并且PFOS在前者血清中的浓度较后者高[6]一个数量级；甚至不仅在人口密集的城市中检测到PFOS，在人迹罕至的高原[7]地带或北极地区中也有检出。PFOS能够通过水、空气、以及食物三种途径进[8]入生物体，其中膳食摄入是最主要的暴露途径。它还可以透过食物链传递及生[9]物放大作用蓄积于生物体内，其在哺乳动物中生物富集能力明显高于无脊椎动[10]物及鱼类。PFOS在环境中的半衰期大于41年，在大鼠体内的半衰期约为100[11][12]天，在人类体内的半衰期达5.4年，在生物体内的平均半衰期为8.7年，最长1 [13]可达21.3年。这些研究结果表明PFOS一种具有持久性、生物蓄积性、远距离环境迁移等特性的有机污染物，也使人们逐渐意识到PFOS带来的毒性效应以及对环境的危害程度已不可小视。2001年，美国环境保护署(EPA)把PFOS列为环境持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants,POPs)。2006年，欧盟明文限制PFOS的使用。2009年，联合国环境规划署(UNEP)将PFOS纳入斯德哥尔摩公约，列为全球范围的化学管理物质。因此，PFOS作为一种新型持久性有机污染物，其健康效应备受关注，是预防医学和环境科学研究领域的研究重点和热点。PFOS独特的化学结构及特性，使它能蓄积于多个组织和器官，蓄积量以肝[14]脏、血液、肾脏及脑组织中较高，有文献报道PFOS在脑中的浓度约为血清中[15]的32%，肝脏中的10%，其通过肾脏及肠道代谢但排除速率缓慢。大量研究逐渐发现PFOS能引起肝脏毒性（肝细胞肿大、空泡化等）、肺毒性（肺不张等）、心脏毒性（心包积液、心室扩张等）、内分泌毒性、免疫毒性（淋巴细胞增殖抑制，巨噬细胞活化功能降低等）、生殖与发育毒性（繁殖与生育能力降低等）及[16]神经毒性。Harada等通过检测人脑脊液、血清和胆汁中PFOS含量，确认中枢神经系统也是PFOS的毒性靶器官，并且有研究显示孕期第九个月妇女的血清[17][18]PFOS含量低于妊娠前，孩子血清中的浓度又往往高于母亲。动物实验也显示，妊娠期暴露的母鼠，其子代PFOS在脑及血液中含量分别是母鼠的3.8-5.4倍[19]和1.1-2.3倍。这说明PFOS能透过胎盘及血脑屏障，还能通过乳汁从母体向子[20][21]代转移。Fuentes等将GD12期母鼠暴露于PFOS，观察发现3月龄小鼠的空间[22]记忆能力受损。Butenhoff等观察发现，GD0大鼠连续暴露于PFOS至PND20期，[23]能导致1.0mg/kg暴露组PND17的子代习服能力下降。王玉等将妊娠期大鼠饮水暴露于PFOS，观察对照组与暴露组交叉哺育的子鼠学习记忆情况，结果显示随着PFOS浓度的增加，仔鼠的学习能力逐渐降低，同时胚胎期暴露对仔鼠学习能力的影响较哺乳期更为显著。还有研究表明PFOS致实验动物产生的认知及行为[24]功能障碍能延续至成年。这些研究结果证实PFOS是一种神经毒性化合物，但是其毒性作用机制还不明确，有待进一步研究。BDNF/TrkB/CREB信号通路参与突触可塑性的调节，在学习记忆中扮演重要角色。BDNF是哺乳动物脑中分布最广、含量最高的神经营养因子(Neurotrophicfactors,NTFs)，1982年由德国神经生物学家Brade从猪脑中分离纯化得到，它由2 神经元、神经支配的靶组织或神经胶质细胞等分泌的多肽，在中枢神经系统中广[25]泛表达，分布于海马、杏仁核、皮质等部位，对神经系统发育有重要意义。BDNF可与低亲和力的神经营养因子受体P75结合，也可与高亲和力的酪氨酸激酶B(TyrosineKinaseB,TrkB)结合，发挥生物学效应，而TrkB作为BDNF的特异2+性受体，二者结合后可以激活MEK/ERK/RSK、PI3K/Akt和Ca/CaM/CaMK信号[26][27]通路，诱导CREB磷酸化，从而激活BDNF等神经营养因子的转录，以促进突触可塑性、增加神经元活性及神经发生。动物实验表明，BDNF基因部分敲除的动物在行为学上会表现出活动过度,富于攻击性和焦虑等症状，而基因全部敲[28]除的大鼠则会在出生后2天左右出现大部分死亡的现象。一些研究发现精神分[29][30]裂症、抑郁症等精神疾病患者以及阿尔兹海默症患者的海马组织中也存在BDNF缺乏的情况。而越来越多的研究显示，应激效应、脑外伤、吸烟、酒精滥[31,32]用、有机化合物的接触等，能够降低BDNF基因的表达，影响学习记忆功能、[33]带来认知障碍，还可能引起一些神经系统疾病。环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMPresponsiveelementbindingprotein,CREB)是一种重要的核转录因子，具有一个KID域，它包含众多磷酸化位点，其中最主要的是Ser-133位点。该磷酸化位点能够被cAMP/PKA、ERK/RSK、2+Ca/CaM/CaMK等信号通路激活，使CREB产生活性。活化后的CREB可与靶基因启动子中的cAMP效应元件(cAMPresponseelement,CRE)结合，进而调控靶基因的转录及表达，受其调控的基因涉及学习记忆、突触可塑性、细胞周期调控、生长繁殖发育等多个方面，这其中包括BDNF、多种神经肽、生长因子神经递质[34]及其受体等。研究表明，磷酸化的CREB(p-CREB)与机体的学习记忆密切相关，在长期记忆的形成中尤为重要，该水平的降低以及CREB的表达不足能够影响[35]LTP及长期记忆。动物实验显示，间歇性低氧能降低小鼠海马CA1区CREB磷[36]酸化水平，造成空间记忆受损。妊娠期镧暴露引起断乳后子代大脑皮质CREB[37]磷酸化水平及BDNF的表达降低，并出现学习记忆能力损害。锌缺乏引起的小[38]鼠学习和记忆功能障碍，可能是与CaM/CaMKII/CREB信号通路中断有关。综合国内外文献及本课题组的前期研究发现，我们推测PFOS所致实验动物认知功能损伤，行为功能异常可能与其干扰了BDNF/TrkB/CREB信号通路的功能有关。因此，本研究以PFOS为受试物，构建生命早期染毒的PFOS神经发育毒性3 模型以及体外神经毒性细胞模型，观察BDNF/TrkB/CREB信号通路相关基因的表达的变化，探讨PFOS暴露可能的神经毒性机制。为进一步研究PFOS的神经毒性提供实验依据。4 第2章围产期PFOS暴露对仔鼠海马BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响PFOS由于其良好的表面活性、极好的稳定性及疏水疏油性被广泛应用生产生活等多个领域，但其难降解的特性也给环境和人类健康带来了严重影响。作为一种新型的持有型有机污染物，虽然PFOS相关的化合物在欧美等众多国家已停产，但它仍在包括中国在内的亚洲及欧洲等市场存在，因此PFOS仍将在未来很长一段时间持续危害生态系统。研究表明，PFOS是一种神经发育毒性化合物，它可以使低龄啮齿类动物神[24]经系统发育迟缓，无论是孕期还是哺乳期PFOS暴露，均能使实验动物的子代[21]产生认知及行为功能障碍，学习和空间记忆能力异常，并且可能影响儿童的粗[39][40]大运动发育，体外实验发现还PFOS能够抑制神经细胞的增殖诱发凋亡效应。BDNF与其受体TrkB特异性结合后能够发挥对学习记忆功能的促进作用，它2+能够激活MAPK/ERK、PI3K/Akt和Ca/CaM/CaMK等信号通路，易化神经递质谷氨酸的合成及释放，增加突触效能，促使CREB磷酸化而激活与长时记忆相关的基因。同时BDNF本身对神经元突触的形成和结构的调节也有助于学习记忆。[41]Sheng等发现，低剂量二氧化硅纳米粒子暴露能够导致斑马鱼脑组织损伤，并[42]抑制CREB基因的表达。Li等将GD6期大鼠连续暴露于500mg/kg邻苯二甲酸二丁酯至GD21天，结果显示子代大鼠海马中BDNF及p-CREB的表达明显降低。同时本课题组前期的研究也证实，孕鼠产前PFOS暴露能导致子代大鼠海马组织的[43]突触超微结构发生改变，突触标志物Syp、突触素(Synapsins)等含量减少。因此，在本部分研究中，我们通过建立小鼠的神经发育毒性模型，观察脑组织的形态学变化，并检测BDNF、TrkB、CREB、Syp及Syn1等基因的表达水平，探讨PFOS是否通过干扰BDNF/TrkB/CREB信号通路而损害子代小鼠的神经系统。2.1实验材料2.1.1实验动物选用10周龄无特定病原体(SpecificpathogenFree,SPF)级昆明种小鼠，体重5 为25-28g，由南华大学实验动物部提供。2.1.2主要试剂+全氟辛烷磺酸钾(KPFOS)德国Fluka公司TrizolReagent美国Invitrogen公司PCR引物序列中国生工生物工程(上海)股份有限公司RevertAid™FirstStrand美国Thermo公司cDNASynthesisKitUniversalSYBR®GreenSupermix美国Bio-Rad公司吐温20(Tween-20)美国sigma公司DEPC水中国碧云天DNAmaker中国北京索来宝科技有限公司H&E染色试剂盒中国北京索来宝科技有限公司Goldview核酸染料中国北京百泰克生物技术有限公司其他常用试剂均为国产分析纯2.1.3主要仪器CW-CJ-IF347型超净工作台中国苏州安泰空气技术有限公司微量加样器德国eppendorf公司数控超级恒温槽中国宁波新芝生物科技股份有限公司制冰机中国广州市广绅电器制造有限公司电子分析天平日本岛津公司PH计德国Sartorius公司PCR仪德国Biometra公司KDC-140HR高速冷冻离心机中国安徽中科中佳科学仪器有限公司核酸定量测定仪美国Bio-Rad公司迷你水平电泳仪北京六一仪器厂凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司iQ5MulticolorReal-TimePCR仪美国Bio-Rad公司石蜡包埋机德国Leica公司石蜡切片机德国Leica公司6 2.2实验方法2.2.1动物饲养与处理选用体重为25-28g、10周龄的SPF级昆明种小鼠，饲养于南华大学动物部SPF动物房屏障系统中，实验动物室温度控制在22-25℃，相对湿度控制在50%-60%，气压差控制在35-45Pa，光线控制在12/12-h循环。常规饲料及饮用水由南华大学动物部提供。适应性饲养1周后，将昆明种小鼠按雌雄比例2:1合笼，第二天早上8：00检查阴栓，发现当天定为怀孕1天(Gestationday1,GD1)，从GD2开始灌胃染毒，至幼鼠出生后21天结束。灌胃量为0.1ml/10g小鼠体重。实验共分为4组：PFOS0.1mg/kg组，PFOS1.0mg/kg组，PFOS5.0mg/kg组，对照组为0.05%Tween-20水溶液。根据母鼠体重增长调整灌胃用量。2.2.2实验动物生长发育情况的观察注意观察母鼠活动、进食情况，及时发现分娩的母鼠。并在幼鼠出生后的1(Postnatalday1,PND1)、3、7、12、21天称量仔鼠体重。2.2.3实验动物样本的收集仔鼠出生后21天，采用颈椎脱臼法处死，将处死后的仔鼠置于冰上，快速取出脑组织，并剥离大脑皮层及海马，-80℃保存备用。2.2.4HE染色2.2.4.1将剥离好的仔鼠脑组织置入4%的多聚甲醛浸泡固定24h，固定后的组织放入PH为7.4的PBS缓冲液中，4℃保存；2.2.4.2酒精梯度脱水后，将组织处理至透明，浸蜡；2.2.4.3石蜡包埋，预热石蜡包埋机，将组织放入已含预融后56-60℃蜡液的包埋框中，注意包埋面的平整，且不要产生气泡；2.2.4.4在切片机上将蜡块切成6μm的薄片，之后将其置于40℃水面上，使其伸展；再将薄片贴于玻片上，40℃烘烤过夜；2.2.4.5用二甲苯将烘烤过的切片脱蜡；2.2.4.6脱蜡后的切片酒精梯度复水后，蒸馏水冲洗；2.2.4.7将切片置于苏木精水溶液中浸染8-15min，洗去浮色后置于浓度为1%的盐酸乙醇中约10s，再次流水冲洗10-15min使组织呈蓝色；7 2.2.4.8组织移入0.5%曙红液中染色2min，再次洗去浮色；2.2.4.9再次酒精梯度脱水，二甲苯处理切片至透明；2.2.4.10用中性树胶封片2.2.5动物组织RNA的提取实验过程中所使用的所有耗材、仪器提前置于无菌操作台紫外线消毒照射1h。2.2.5.1快速称取约100mg海马组织，置于无RNase的玻璃匀浆器中；2.2.5.2向其中加入1mltrizol，冰水浴快速匀浆；2.2.5.3匀浆充分后将将组织匀浆液转入1.5mlEP管中，室温静置5min，是组织能够充分裂解；2.2.5.4向EP管内加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15min；2.2.5.54℃条件下12000g离心15min；2.2.5.7离心后可见样品分为三层，分别为：上层的无色水相、中间层以及下层的酚相，RNA存在于上层中，而中间层为蛋白质，随即取上层水相移至另一EP管；2.2.5.8向管中加入0.5ml的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；2.2.5.94℃条件下12000g离心10min；2.2.5.10移去上清，见白色RNA沉淀于管底；2.2.5.11向管中加入75%的乙醇，颠倒振荡EP管，悬浮沉淀；2.2.5.124℃条件下8000g离心5min，尽量去上清；2.2.5.13将沉淀室温晾干5min，用50μl冰浴的DEPC水溶解RNA沉淀。2.2.6RNA浓度及完整性的检测2.2.6.1RNA纯度及浓度的检测用核酸定量测定仪检测RNA(样品用双蒸水稀释)的吸光度，仔细记录260nm与280nm吸光度的值，计算A/A260280的值判断RNA的纯度(该值在1.8-2.0之间为好，＜1.8说明样品中可能含有酚或蛋白质，＞2.0说明RNA可能存在降解)用公式RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000计算出RNA浓度(1OD约为40μg/ml单链RNA)2.2.6.2RNA完整性的检测8 配置1%的琼脂糖凝胶：取0.2g琼脂糖置于20ml0.5×TBE缓冲液，微波炉加热至完全溶解，稍冷却后加入1μlGoldview核酸染料，充分摇匀，倒入搅槽中插入梳子，待凝胶凝固后移至电泳槽；电泳条件为100V，20min，凝胶成像分析系统下观察电泳结果，三条条带5S、18S及28S均清晰无拖尾，28S条带较亮，约为18S的两倍。2.2.7cDNA的合成按照美国Thermos公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit提供的说明书进行操作：2.2.7.1第一步：试剂20μl体系所占体积TotalRNA2.5μgOligo(dT)18primer1μlDEPC水至12μl短暂离心后，将PCR管置于PCR仪，65℃孵育5min，迅速冷却后，稍离心液体使其集于管底。2.2.7.2第二步：将第一步所得产物置于冰上，加入以下溶液：试剂20μl体系所占体积5×ReactionBuffer4μlRiboLockRNaseInhibitor(20U/μl)1μl10mMdNTPMix2μlRevertAidM-MuLVRT(200U/μl)1μl两步反应终体积为20μl。离心使所有溶液混匀后，将PCR管置于PCR仪，42℃孵育60min，70℃孵育5min，反应结束后，-70℃保存。2.2.8QPCR2.2.8.1引物的合成引物序列（表2.1）使用Primer5.0软件设计，由中国生工生物工程(上海)股份有限公司合成。9 表2.1QPCR引物序列信息引物名称引物序列产物(bp)BDNFF:CCTCTTGGGGTTAGGAGAAGTCA197R:GCCACTTTGTTTCACCCTTTCCTrKBR:CTGCTGGTGAAAATTGGGGACT198F:GGGCTGCTTGCCGTAGGTGCREBF:GTTCGTCCGTGCCACCTTG92R:TGAGCCTGCCTTCCACTTGATSyn1F:GGGATGGGCAAGGTCAAGGT99R:AATGAAGGGCTCAGCAGTGGCSypF:GCTGCTGGCAGACATGGACG115R:GGCGAAGATGGCAAAGACCCβ-actinF:TCTTTTCCAGCCTTCCTTCTTG101R:AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG2.2.8.2QPCR反应体系（20μl）试剂20μl体系所占体积cDNA模板1μlSYBR®GreenSupermix10μlForwardPrimer(10μM)1μlReversePrimer(10μM)1μl无菌水7μl2.2.8.3QPCR反应条件反应温度反应时间95℃预变性10min95℃变性15s40个60℃退火延伸1min循环增加溶解曲线-ΔΔct2.2.8.4根据比较CT值的相对定量法，采用2值法分析mRNA相对表达量。具体方法：将溶剂Tween-20组作为对照组，设置其mRNA表达量的为1，用处理组与对照组比较。其中Δct目的基因=ct（目的基因）-ct(同一样本的内参基因)10 ΔΔct目的基因=处理组Δct目的基因-对照组Δct目的基因-ΔΔct相对表达量（即处理组/对照组）=22.3统计分析实验数据采用SPSS18.0软件进行统计分析，用x±S表示，组间比较运用单因素方差分析。进一步进行两两比较，方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Dunnett'sT3检验。检验水准α=0.05，P<0.05认为有统计学意义。2.4结果2.4.1围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠存活率的影响幼鼠出生后，观察其死亡情况，结果如表2.2所示，幼鼠PND21天的存活率与对照组的存活率相比，二者无显著性差异(P>0.05)。表2.2围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠存活率的影响PFOS(mg/kg-day)总幼鼠（只）活幼鼠（只）生存率(%)0.0585798.30.1626198.41.0555294.55.0575393.02.4.2围产期PFOS暴露对出生后幼鼠体重的影响母鼠经0、0.1、1.0、5.0μM的PFOS处理后，分别称量其出生1天，3天，7天，12天和21天幼鼠的体重，与对照组做比较，处理组幼鼠体重无明显变化(P>0.05)（表2.3）。表2.3围产期PFOS暴露对出生后幼鼠体重的影响(xs)PFOS样本数体重(g)(mg/kg-day)(n)PND1PND3PND7PND12PND210.0581.64±0.112.35±0.124.21±0.416.59±0.8810.78±1.490.1621.66±0.132.41±0.134.11±0.386.48±0.8710.27±1.321.0551.58±0.122.44±0.114.15±0.526.54±0.9710.42±1.685.0571.59±0.222.25±0.144.01±0.426.45±0.8910.41±1.652.4.3围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠脑组织病理形态的影响幼鼠出生后21天，颈椎脱臼处死幼鼠，分离脑组织，4%多聚甲醛固定24h，11 常规石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察组织病理形态。2.4.3.1PFOS暴露对幼鼠大脑皮层组织结构的影响观察发现，对照组与5.0mg/kgPFOS处理组中，幼鼠大脑皮层组织细胞均排列整齐，有规则，无空泡，无染色质浓缩等异常现象。该结果表明围产期PFOS暴露未导致幼鼠大脑皮层出现病理损伤。（图2.1，A和B）2.4.3.2PFOS暴露对幼鼠海马组织结构的影响实验结果显示，对照组幼鼠海马组织细胞排列紧密，形态规则，界限清晰，胞质丰富，核大且圆，核仁清晰。5.0mg/kgPFOS处理组幼鼠后，海马组织出现明显空泡。该结果表明围产期PFOS暴露导致了幼鼠海马组织的病理改变。（图2.1，C和D）图2.1.围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠脑组织病理形态的影响(10×40)A:对照组大脑皮层，B:5.0mg/kg大脑组皮层；C:对照组海马，D:5.0mg/kg组海马12 2.4.4围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA表达的影响应用QPCR检测出生后21天幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA表达水平，结果显示（见表2.4），与对照组相比，CREBmRNA表达水平随着PFOS剂量的增加而降低；BDNF及TrkBmRNA表达水平则在0.1mg/kgPFOS处理组略有升高，在1.0及5.0mg/kgPFOS处理组呈下降趋势。三个处理组中，0.1及1.0mg/kgPFOS处理组幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA相对表达量与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，而5.0mg/kgPFOS处理组幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA相对表达量与对照组相比分别降低了78%、23%以及63%，差异具有统计学意义(P<0.05)。表2.4.围产期PFOS暴露对幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREBmRNA表达的影响(xs,n5)PFOS(mg/kg-day)BDNFTrkBCREB0.01110.11.09±0.121.01±0.240.90±0.251.00.71±0.330.95±0.150.85±0.275.00.22±0.21*0.71±0.14*0.37±0.26*备注：*表示与对照组比较P<0.052.4.5围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织Syp、Syn1mRNA表达的影响应用QPCR检测出生后21天幼鼠海马组织Syp、Syn1mRNA表达水平，结果显示（见表2.5），与对照组相比，Syp、Syn1mRNA的相对表达量随着PFOS剂量的增加而减少，呈剂量依赖关系。与对照组相比，0.1mg/kgPFOS处理组幼鼠海马组织Syp、Syn1mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05)，而1.0及5.0mg/kgPFOS处理组幼鼠海马组织SypmRNA相对表达量分别降低了59%及61%，Syn1mRNA相对表达量分别降低了29%及37%，差异具有统计学意义(P<0.05)。13 表2.5围产期PFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织Syp、Syn1mRNA表达的影响(xs,n5)PFOS(mg/kg-day)SypSyn10.0110.10.95±0.240.94±0.181.00.41±0.23*0.71±0.17*5.00.39±0.19*0.63±0.19*备注：*表示与对照组比较P<0.052.5讨论全氟化合物(Perfluorinatedcompounds,PFCs)是指化合物分子中与碳原子连接的氢原子全部被氟原子取代的一类有机化合物，被广泛应用于生产生活的多个领域。近年来，PFCs作为一种新型的持久性有机污染物，其对环境及人类的危害已成为全球关注的热点。全氟辛烷磺酸盐(Perfluorooctanesulfonate,PFOS)是PFCs的典型代表物，已在多种环境介质中检出。研究发现PFOS能够蓄积于多种生物的多个器官与组织中，蓄积量以肝脏、血液、肾脏及脑组织中较高。随着人们对PFOS认识的增强以及研究者不断的探索，国内外学者逐渐发现PFOS能够引起肝脏、肺脏、心血管、内分泌、免疫、生殖及神经多系统多器官的毒性。而发育中的神经系统更为敏感性，所遭受的损害持久且不可逆，故PFOS神经发育毒性的备受关注。研究表明，PFOS能够影响啮齿类动物的[44][45,46]行为，导致斑马鱼、非洲爪蟾等实验动物胚胎畸形，引发脑坏死，并降低学习记忆以及认知水平。[47]Lau等将妊娠期小鼠暴露于1.0至20mg/kg的PFOS，结果发现在15及20mg/kg暴露组，子代小鼠全部在24h内死亡；10mg/kgPFOS暴露为半数致死剂量；而与对照组相比，1及5mg/kg暴露组小鼠存活率无显著性差异。本研究中采用0.1-5mg/kgPFOS处理孕鼠，结果表明在此剂量范围内，PFOS没有引起仔鼠的体重、死亡率以及母鼠体重的变化。我们的研究结果显示5.0mg/kgPFOS组不仅没有影响到仔鼠的畸形与死亡，而且也没有影响仔鼠的生长发育。这与Lau等报道的研究结果一致。因此，可以认为本研究构建的PFOS发育毒性模型是可行且合理的。14 在哺乳动物中，海马是一个重要的大脑边缘系，是学习和记忆的关键部位，其结构的完整对新信息的获取、空间学习以及记忆的储存和巩固有重要作用。文献报道，PFOS导致啮齿类动物的空间学习记忆能力缺陷，与动物的海马区受损[48][49]有关。陈娜等研究认为40mg/kgPFOS暴露引起的小鼠海马区神经元丢失及[50]形态改变，以及学习记忆功能异常，两者具有相关性。Long等研究表明PFOS长时间暴露能通过引发成年小鼠海马神经细胞凋亡，造成海马组织病变最终导致空间学习记忆障碍。在本研究中，小鼠脑组织病理形态学检测显示，与对照组相比，PFOS处理组造成仔鼠海马组织细胞空泡，而对幼鼠大脑皮层组织无明显影响。这表明PFOS对海马组织的损伤比皮层组织敏感。BDNF/TrkB/CREB信号分子参与神经元发育、突触连接和长时程增强(Long-termPotentiation,LTP)形成，调节突触蛋白合成，提高突触效能，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需，并在学[51]习和记忆中扮演着重要的角色。BDNF是神经营养因子家族的重要成员之一，在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织中广泛分布，在海[52]马组织中表达最为丰富。BDNF与其特异性受体TrkB结合后，激活MAPK信号通路，进而激活CREB，参与在神经系统发育、抑郁、成瘾性，而CREB表达不[35]足或磷酸化水平降低能影响长时程记忆形成。本研究显示，围产期0.1、1.0mg/kgPFOS暴露对出生后21天幼鼠海马组织BDNF、TrkB及CREB基因mRNA表达无明显影响，但在5.0mg/kgPFOS暴露组中上述基因mRNA表达水平显著降低。突触是神经元之间信息传递的关键部位，由突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分构成。突触前膜中包含许多突触囊泡，神经递质就位于其中，而突触囊泡相关蛋白的活化有助于神经递质的释放。BDNF/TrkB/CREB信号通路激活后能促进突触蛋白(Synapsin,Syn)表达，诱导长时程增强，调节树突形成及树突棘形态，从而实现突触活性增强。突触蛋白(Synapsin,Syn)家族是一组具与有神经元特异性的磷酸化蛋白，包括突触蛋白1(Syn1)、突触蛋白2(Syn2)和突触蛋白3(Syn3)。它们位于突触囊泡外膜上，能够通过影响突触结构、自身磷酸化调节神经递质释放，促进神经元轴突[53]生长，增强突触联系，在突触可塑性中起作用。Syn1作为BDNF/TrkB信号通15 路的下游效应分子，它的表达及磷酸化受该信号通路的调控。研究表明，运动能够增加BDNF及其受体mRNA的表达，从而上调Syn1、GAP-43以及CREBmRNA[54]的表达水平，以此来调节神经元的突触可塑性。并且完成学习空间记忆任务越快的实验动物，其海马组织中BDNF的表达越高。相反外源性刺激实验动物出现空间学习能力下降的同时，BDNF、CREB、Syn1以及GAP-43的表达水平也相应[55]降低。突触囊泡蛋白(Synaptophysin,Syp)是一种突触囊泡外膜上含量最为丰富的突触囊泡相关蛋白，也是膜转运蛋白家族的一员。它参与形成融合孔，促使神经[56]递质释放至突触间隙，与胞吐密切相关。研究表明，Syp的变化能够间接反映体内突触数量及分布，在突触重建及认知过程中起重要作用，Syp缺乏能损伤海[57][58]马依赖性的LTP，造成学习记忆功能减退。Skalska等运用动物模型研究银纳米粒子神经毒性机制，结果发现，银纳米粒子显著降低了大鼠皮层及海马组织中Syn1、Syp以及PSD-95蛋白水平，并且造成了海马突触超微结构的改变。赵[59]琦等的研究认为，铅染毒导致的小鼠学习记忆功能障碍可能与铅暴露所致小鼠[60]海马区Syp蛋白表达明显下降有关。Shang等研究发现创伤性脑损伤(TBI)在影响成年小鼠的学习记忆能力的同时降低了与学习记忆相关基因BDNF、Syn1、Syp的表达。本研究结果显示，围产期不同浓度的PFOS暴露导致了出生后21天幼鼠海马组织Syn1和SypmRNA表达的下降，并且其表达水平随着PFOS浓度的升高而降低，呈剂量反应关系。2.6小结围产期PFOS暴露能够造成子代小鼠海马组织损伤，BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因表达下降，并能导致突触相关蛋白Syn1及Syp表达降低，这可能是PFOS神经发育毒性的作用机制之一。16 第3章PFOS暴露对SH-SY5Y细胞BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响人成神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y衍生于人神经母细胞瘤系SK-N-SH，是一种分化程度较低的肿瘤细胞。该细胞繁殖速度快，并且在形态、生理、生化功能[61]上与正常神经细胞相似。被广泛应用在研究神经系统疾病发病机理及药物筛选等方面。鉴于第二章的实验结果，本部分研究将以SH-SY5Y细胞为神经毒性模型，用不同浓度PFOS处理SH-SY5Y细胞，MTT法检测细胞活力并观察其形态学改变，通过QPCR法检测BDNF基因的mRNA表达水平，ELISA法检测BDNF以及Westernblot法检测CREB、p-CREB以及TrkB蛋白表达水平。进一步研究PFOS对BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响。3.1实验材料3.1.1细胞系的选择人成神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y由中国科学院动物研究所分子毒理研究组伍一军研究员馈赠传代培养。3.1.2主要试剂+全氟辛烷磺酸钾(KPFOS)德国Fluka公司DMEM高糖液体培养基美国Thermo公司特级胎牛血清浙江天杭生物科技有限公司青霉素-链霉素溶液(100X)中国碧云天胰蛋白酶中国北京索来宝科技有限公司二甲基亚砜(DMSO0中国北京索来宝科技有限公司噻唑蓝美国Amersco公司TrizolReagent美国Invitrogen公司PCR引物序列中国生工生物工程(上海)股份有限公司FirstStrandcDNASynthesisKit美国Thermo公司UniversalSYBR®GreenSupermix美国Bio-Rad公司17 DEPC水中国碧云天DNAmaker中国北京索来宝科技有限公司Goldview核酸染料中国北京百泰克生物技术有限公司琼脂糖中国北京百泰克生物技术有限公司HumanBDNFELISAKit美国RayBiotech公司PageRuler预染蛋白Ladder美国Thermo公司甘氨酸中国Biosharp公司SDS中国Biosharp公司Tris-base中国Biosharp公司丙烯酰胺中国Biosharp公司甲叉双丙烯酰胺中国Biosharp公司过硫酸铵中国Biosharp公司四甲基二乙胺美国Amersco公司吐温20(Tween-20)美国sigma公司RIPA裂解液(强)中国碧云天牛血清白蛋白(BSA)中国Biosharp公司PVDF膜美国Millipore公司Rabbitanti-CREB美国CST公司Rabbitanti–p-CREB美国CST公司Mouseanti-TrkB美国Santa公司Mouseanti-β-actin美国Bioworld公司山羊抗小鼠IgGHRP中国Biosharp公司山羊抗兔IgGHRP中国Biosharp公司BeyoECLPlus(超敏ECL化学发光试中国碧云天剂盒)3.1.3主要仪器超低温冰箱(-80℃)美国Harris公司SW-CJ-2FD洁净工作台中国苏州安泰空气技术有限公司微量加样器德国eppendorf公司18 CO2培养箱美国Thermo公司CKX41倒置显微镜日本Olympus公司SK-1快速混匀器中国江苏国华仪器厂ELX-800型酶标仪美国BIO-TEK公司DMIL型荧光倒置显微镜德国Leica公司KDC-140HR高速冷冻离心机中国安徽中科中佳科学仪器有限公司台式离心机中国上海安亭科学仪器厂掌上型迷你离心机美国Bio-Rad公司三用恒温水浴箱中国天津泰斯特仪器有限公司制冰机中国广州市广绅电器制造有限公司电子分析天平日本岛津公司PH计德国Sartorius公司PCR仪德国Biometra公司核酸定量测定仪美国Bio-Rad公司迷你水平电泳仪北京六一仪器厂凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司iQ5MulticolorReal-TimePCR仪美国Bio-Rad公司迷你电转膜仪北京六一仪器厂迷你垂直电泳仪北京六一仪器厂6200凝胶成像系统中国上海天能科技有限公司3.2实验方法3.2.1主要试剂的配置3.2.1.1MTT溶液：称取MTT粉末50mg溶解于80ml超纯水，避光溶解，置于37℃恒温箱中过夜。待粉末完全溶解后，定容至100ml，用0.22μm过滤器，过滤分装，-20℃避光保存。MTT溶液终浓度为0.5mg/ml；3.2.1.2PBS缓冲液：称取NaCl8.0g，KCl0.2g，NaHPO41.44g，KH2PO40.24g，溶解于800ml超纯水，磁力搅拌器搅拌均匀，调整PH至7.4，并定容至1000ml，高压灭菌4℃保存备用；3.2.1.3胰蛋白酶：称取0.25g胰酶，溶解于80mlPBS中，待粉末完全溶解后，19 定容至100ml，用0.22μm过滤器，过滤分装，4℃保存备用；3.2.1.410×TBE电泳缓冲液：称取Tris108g，硼酸55g，EDTA9.3g，溶解于800ml超纯水中，调整PH至8.0，并定容至1000ml，室温备用；3.2.1.5Westernblot相关试剂的配置：（1）10%SDS：称取10gSDS粉末溶解于80ml超纯水中，50℃水浴待粉末完全溶解后，定容至100ml，室温保存；（2）10%APS：称取0.1gAPS粉末溶解于1ml超纯水中，4℃保存一周；（3）30%聚丙烯酰胺：称取丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，溶解于80ml超纯水中，待粉末完全溶解后，定容至100ml，4℃避光保存；（4）1.5MTris-HCl(PH8.8)：称取Tris45.43g，溶解于150ml超纯水，浓盐酸调PH至8.8，并定容至250ml，室温保存；（5）0.5MTris-HCl(PH6.8)：称取Tris15.14g，溶解于150ml超纯水，浓盐酸调PH至6.8，并定容至250ml，室温保存；（6）1MTris-HCl(PH7.5)：称取Tris30.29g，溶解于150ml超纯水，浓盐酸调PH至7.5，并定容至250ml，室温保存；（7）5×电泳缓冲液：称取Tris15.2g，甘氨酸94g，SDS5g，溶解于800ml超纯水，待粉末完全溶解后，定容至1000ml，室温保存；（8）10×转膜缓冲液：称取Tris58g，甘氨酸29g，SDS3.7g，溶解于800ml超纯水，待粉末完全溶解后，定容至1000ml，室温保存。取100ml稀释至800ml后加入200ml甲醇使之混匀成为工作液；（9）10×TBS缓冲液：取1MTris•HCl(pH7.5)100ml，Nacl88g，溶解于800ml超纯水，待粉末完全溶解后，定容至1000ml，室温备用；（10）TBST缓冲液：取100ml10×TBS缓冲液超纯水稀释至1000ml，加入1mlTween20溶液混匀，室温备用；3.2.2细胞培养SH-SY5Y细胞培养于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中(含终浓度为100U/mL的青霉素及100μg/ml链霉素)，置于37℃，5%CO2饱和湿度的恒温培养箱。取对数生长期且融合至85-90%的细胞用于实验。PFOS用DMSO配置成200μM的储备液，后逐一稀释成150、100、50、10μM20 的染毒液，4℃保存，对照组与处理组细胞中的DMSO终浓度为0.1%(V/V)3.2.3MTT检测细胞活力3将对数生长期的SH-SY5Y细胞以3×10/孔的密度接种于96孔板中，细胞贴壁24h后，用0、10、50、100、150、200μMPFOS处理细胞48h，每孔分别加入终浓度为0.5mg/mL的MTT，避光37℃恒温箱孵育，4h后吸出培养基加入100μlDMSO，室温震荡待紫色结晶溶解，置于酶标仪490nm读取吸光度值。每个浓度设置3个平行孔，实验重复3次。细胞存活率(%)=（处理组-空白）/（对照组-空白）×100%。3.2.4细胞RNA的提取实验过程中所使用的所有耗材、仪器提前置于无菌操作台紫外线消毒照射1h。3.2.4.1染毒结束后，弃六孔板中培养液，PBS缓冲液清洗细胞，重复3次，弃板中废液；3.2.4.2向每个孔中加入1mltrizol，反复吹打细胞使之充分裂解后，将液体转入1.5mlEP管中，室温静置5min；3.2.4.3向EP管内加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15min；3.2.4.44℃条件下12000g离心15min；3.2.4.5离心后可见样品分为三层，分别为：上层的无色水相、中间层以及下层的酚相，RNA存在于上层中，而中间层为蛋白质，随即取上层水相移至另一EP管；3.2.4.6向管中加入0.5ml的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；3.2.4.74℃条件下12000g离心10min；3.2.4.8移去上清，见白色RNA沉淀于管底；3.2.4.9向管中加入75%的乙醇，颠倒振荡EP管，悬浮沉淀；3.2.4.104℃条件下8000g离心5min，尽量去上清；3.2.4.11将沉淀室温晾干5min，用50μl冰浴的DEPC水溶解RNA沉淀。3.2.5RNA浓度及完整性的检测3.2.5.1RNA纯度及浓度的检测用核酸定量测定仪检测RNA(样品用双蒸水稀释)的吸光度，仔细记录260nm21 与280nm吸光度的值，计算A/A260280的值判断RNA的纯度(该值在1.8-2.0之间为好，＜1.8说明样品中可能含有酚或蛋白质，＞2.0说明RNA可能存在降解)用公式RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000计算出RNA浓度(1OD约为40μg/ml单链RNA)3.2.5.2RNA完整性的检测配置1%的琼脂糖凝胶：取0.2g琼脂糖置于20ml0.5×TBE缓冲液，微波炉加热至完全溶解，稍冷却后加入1μlGoldview核酸染料，充分摇匀，倒入搅槽中插入梳子，待凝胶凝固后移至电泳槽；电泳条件为100V，20min，凝胶成像分析系统下观察电泳结果，三条条带5S、18S及28S均清晰无拖尾，28S条带较亮，约为18S的两倍。3.2.6cDNA的合成按照美国Thermos公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit提供的说明书进行操作：3.2.6.1第一步：试剂20μl体系所占体积TotalRNA2.5μgOligo(dT)18primer1μlDEPC水至12μl短暂离心后，将PCR管置于PCR仪，65℃孵育5min，迅速冷却后，稍离心液体使其集于管底。3.2.6.2第二步：将第一步所得产物置于冰上，加入以下溶液：试剂20μl体系所占体积5×ReactionBuffer4μlRiboLockRNaseInhibitor(20U/μl)1μl10mMdNTPMix2μlRevertAidM-MuLVRT(200U/μl)1μl两步反应终体积为20μl。离心使所有溶液混匀后，将PCR管置于PCR仪，42℃孵育60min，70℃孵育5min，反应结束后，-70℃保存。22 3.2.7QPCR3.2.7.1引物的合成引物序列（表3.1）使用Primer5.0软件设计，由中国生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表3.1QPCR引物序列信息引物名称引物序列产物(bp)BDNFF:AGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAG129R:ATTGCTTCAGTTGGCCTTTTGATACβ-actinF:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTT126R:ACTTCCTGTAACGCATCTCATA3.2.7.2QPCR反应体系(20μl)试剂20μl体系所占体积cDNA模板1μlSYBR®GreenSupermix10μlForwardPrimer(10μM)1μlReversePrimer(10μM)1μl无菌水7μl3.2.7.3QPCR反应条件反应温度反应时间95℃预变性10min95℃变性15s40个58℃退火延伸1min循环增加溶解曲线-ΔΔct3.2.7.4根据比较CT值的相对定量法，采用2值法分析mRNA相对表达量。具体方法：将溶剂Tween-20组作为对照组，设置其mRNA表达量的为1，用处理组与对照组比较。其中Δct目的基因=ct（目的基因）-ct(同一样本的内参基因)ΔΔct目的基因=处理组Δct目的基因-对照组Δct目的基因-ΔΔct相对表达量（即处理组/对照组）=223 3.2.8酶联免疫分析法检测BDNF基因的蛋白表达水平按照美国RayBiotech公司HumanBDNFELISAKit提供的说明书进行操作，所有试剂使用前先放至室温30min。3.2.8.1染毒结束后，分别吸取各处理组细胞上清液至1.5mlEP管中，6000rpm/min离心10min,再次收集上清液，备用；3.2.8.2样本的稀释：分别吸取各处理组细胞上清液20μl，用1×稀释液B将其稀释5倍至100μl，充分混匀，备用；3.2.8.3标准品的制备：取BDNF标准品（C管），稍离心后向其中加入1×稀释液B制成400ng/ml的标准品，轻摇混匀。从C管中取出10μlBDNF标准品入1.5mlEP管，向管中加入90μl１×稀释液B制成40ng/ml标准品稀释液,再依次稀释成16ng/ml、6.4ng/ml、2.56ng/ml、1.02ng/ml、0.41ng/ml、0.16ng/ml、0.66ng/ml、0ng/ml；3.2.8.4取各浓度标准品及稀释好的各剂量组样品100μl至各反应孔中，所有样品及标准品做双份检测，室温下封口孵育2.5h；3.2.8.5去除各反应孔中溶液，甩干。用1*的洗板液洗板4次（取300μl洗板液充满每个孔，震荡30s），完全除去每一步洗板的残液（甩去）,之后倒置微孔板在干净的吸水纸上；3.2.8.6取100μl1×BDNF抗体检测液至每一反应孔，轻微震动室温下封口孵育1h；3.2.8.7重复1.2.8.5；3.2.8.8取100μl的1×HRP链霉亲和素至每一反应孔，轻微震动室温下封口孵育45min；3.2.8.9重复1.2.8.5；3.2.8.10取100μl的TMB底物显色液到每反应一孔，轻微震动室温下避光封口孵育30min；3.2.8.11取50μl终止液至每一反应孔，之后至酶标仪450nm处读数。3.2.8.12标准曲线的制定及样本BDNF浓度的计算以BDNF标准品浓度（0、0.066、0.16、0.41、1.02、2.56、6.4、16以及40ng/ml）为横坐标，以各浓度所对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，获得标准曲线回24 归方程。将样品所测OD值带入方程，算出样品浓度，乘以稀释倍数，即得到样品的实际浓度。标准曲线见图3.1：图3.1BDNF标准曲线3.2.9Westernblot检测蛋白表达3.2.9.1细胞总蛋白的提取6将对数生长期的SH-SY5Y细胞以4×10的密度接种于10cm培养皿中，待细胞生长至80%，用0、10、50、100μMPFOS处理细胞，48h后收集经处理后的各组细胞，每皿加入150μl含1%PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000g，4℃离心20min。离心后取上清进行蛋白定量以及蛋白变性等步骤。3.2.9.2蛋白浓度的测定参照碧云天BCA法蛋白定量试剂盒说明书测定各组样本蛋白浓度，步骤如下：（1）配置工作液：根据样品总量，按照50倍体积BCA试剂A液加1倍体积BCA试剂B液(即50:1)配制适量BCA工作液，混匀；（2）标准品稀释：用1×PBS缓冲液将10μl标准品稀释至100μl，使其终浓度为0.5mg/ml；（3）依次将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板孔中，并用1×PBS缓冲液补足至20μl；25 （4）蛋白样品稀释：按照1：20的比例用1×PBS缓冲液稀释样品，混匀后取20μl样品稀释液加入到96孔板中，各浓度孔设置3个复孔；（5）每孔加入200μlBCA工作液，放置于37℃恒温孵育30min；（6）酶标仪检测490nm波长处OD值，根据标准品的结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算出蛋白浓度。3.2.9.3SDS-PAGE电泳（1）灌制8%分离胶和5%浓缩胶，配方如下：分离胶浓度浓缩胶浓度成分（ml)8%8%10%10%5%超纯水3.35.02.74.03.430%Acr-Bis2.74.03.35.00.831.5MTris-HCl(PH8.8)3.85.73.85.7-0.5MTris-HCl(PH6.8)----0.6310%SDS0.10.150.10.150.0510%APS0.10.150.10.150.05TEMED0.0060.0090.0040.0060.004总体积（ml）101510155（2）取蛋白质分子量标准液4μl及各处理组细胞总蛋白100μg进行上样，每孔最大上样量不超过20μl，不足20μl用1×蛋白上样缓冲液补齐；（3）浓缩胶电泳采用90V电压，样品完全进入分离胶后电压调至120V，溴芬兰指示剂距离胶底1cm时停止电泳；（4）保留目的蛋白质分子量位置的分离胶并置于转膜缓冲液中，再根据所保留胶的大小剪切PVDF膜，PVDF膜放置于甲醇溶液中浸泡2min后移入转膜缓冲液，之后按滤纸——胶——膜——滤纸顺序放置组装夹板，300mA恒流转膜2h；（5）转移完成后，将PVDF膜浸于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，室温摇床封闭1h；（6）取出PVDF膜，用TBST清洗，之后加入按比例稀释的一抗（Mouseanti-TrkB、Rabbitanti-CREB、Rabbitanti-p-CREB，1:1000），在4℃孵育过夜；（7）回收一抗，TBST溶液清洗PVDF膜3次，置于摇床每次10min；（8）加入TBST稀释的二抗(HRPGoatantiRabbit(Mouse)IgG，1:3000)，室温下26 孵育1h；（9）TBST洗膜3次，每次10min；（10）按1:1的比例混合ECL发光液A液及B液，混匀后滴于PVDF膜的蛋白面，凝胶成像系统进行显影；（11）QuantityOne软件进行分析光密度值。3.3统计分析实验数据采用SPSS18.0软件进行统计分析，用x±S表示，组间比较运用单因素方差分析。进一步进行两两比较，方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Dunnett'sT3检验。检验水准α=0.05，P<0.05认为有统计学意义。3.4结果3.4.1PFOS对SH-SY5Y细胞存活率的影响不同浓度PFOS(0、10、50、100、150、200μM)处理SH-SY5Y细胞48h后，各PFOS处理组与对照组相比，10μMPFOS处理组细胞出现一个较小的增殖现象，而50-200μM处理组则对细胞增殖产生明显的抑制，细胞的存活率逐渐降低(P<0.05)，并呈浓度依赖关系。（图2-1）图3.2PFOS处理48h后对SH-SY5Y细胞存活率的影响备注：*表示与对照组比较P＜0.0527 3.4.2PFOS对SH-SY5Y细胞形态的影响不同浓度PFOS(0、10、50、100、150、200μM)处理SH-SY5Y细胞48h后，形态学观察发现，对照组细胞呈不规则多边形，轮廓清晰、有短突起。10μMPFOS处理组细胞与对照组相比变化不明显。但随着PFOS处理浓度的增加，细胞逐渐开始出现胞体变小，边界不清，突起消失等现象，并且圆形细胞逐渐增多，悬浮于培养液中的死细胞逐渐增多。（图3.3）。图3.3PFOS处理48h后对SH-SY5Y细胞形态的影响(10×20)A：溶剂对照组(0μM)；B：10μMPFOS处理组；C：50μMPFOS处理组；D：100μMPFOS处理组；E：150μMPFOS处理组；F：200μMPFOS处理组；28 3.4.3PFOS对SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响不同浓度PFOS(0、10、50、100μM)处理SH-SY5Y细胞48h后，应用QPCR及酶联免疫分析法检测SH-SY5Y细胞中BDNF基因的表达情况，结果显示（见表3.2），PFOS暴露降低了BDNF基因的表达，其蛋白及mRNA表达水平并随着PFOS剂量的增加而降低。与对照组相比，10μMPFOS对SH-SY5Y细胞内BDNFmRNA水平无明显影响(P>0.05)，50-100μMPFOS则显著性降低细胞内BDNFmRNA表达水平(P<0.05)；在10-50PFOS处理组，SH-SY5Y细胞内BDNF蛋白含量无明显变化(P>0.05)，100μMPFOS处理组中SH-SY5Y细胞内BDNF蛋白含量则显著性降低(P<0.05)。表3.2PFOS对SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响(xs）PFOS（μM）BDNFmRNA相对表达量BDNF含量（ng/ml）01124.25±17.13100.86±0.16114.38±12.59500.65±0.10*104.73±7.911000.57±0.07*92.33±5.83*备注：*表示与对照组比较P＜0.053.4.4PFOS对SH-SY5Y细胞TrkB与CREB蛋白表达的影响不同浓度PFOS(0、10、50、100μM)处理SH-SY5Y细胞48h后，应用Westernblot法检测SH-SY5Y细胞TrkB、CREB及p-CREB蛋白表达水平，结果见图3.4。从图3.4A可知，与对照组相比，10-50μMPFOS增加了SH-SY5Y细胞内TrkB蛋白的相对表达量，并在10μM处理组有统计学意义(P<0.05)，而当100μMPFOS处理细胞时，细胞内TrkB的蛋白相对表达量则显著性降低(P<0.05)。从图3.4B可知，与对照组相比，PFOS降低了SH-SY5Y细胞内CREB蛋白表达水平，并随PFOS浓度的增加呈下降趋势，尤其在100μMPFOS处理组CREB蛋白的相对表达量显著下降(P<0.05)。从图3.4C可知，与对照组相比，PFOS升高了SH-SY5Y细胞内p-CREB蛋白表达水平，其相对表达量在10μMPFOS处理组有统计学意义(P<0.05)。从图3.4D可知，与对照组相比，PFOS显著升高了SH-SY5Y细胞内CREB蛋白的磷酸化水平，并随PFOS浓度的增加呈上升趋势(P<0.05)。29 ABCDE图3.4不同浓度PFOS对SH-SY5Y细胞TrkB、CREB蛋白表达的影响A：TrkB蛋白表达水平；B：CREB蛋白表达水平；C：p-CREB蛋白表达水平D：p-CREB与CREB蛋白表达水平比值；E：TrkB、CREB、p-CREBWesternblot电泳条带泳带1：0μM；泳带2：10μMPFOS组；泳带3：50μMPFOS组；泳带4：100μMPFOS组；备注：*表示与对照组比较P＜0.0530 3.5讨论大量研究证实，BDNF/TrkB/CREB信号通路在学习记忆功能中有重要作用，前面的研究也从动物实验验证了这一观点。在本章我们选用了SH-SY5Y细胞为神经毒性模型，来观察PFOS对该神经细胞模型产生的毒性作用，探讨这种毒性作用中是否也干扰了BDNF/TrkB/CREB信号通路的关键基因。SH-SY5Y细胞是来源于1970年建立的一神经母细胞瘤患者的转移骨瘤灶细胞SK-N-SH经过三次克隆后的亚系。该细胞显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性，其在形态与功能上与正常神经元类似。常作为神经细胞模型广泛应于神经系统疾病发病机制、药物筛选等研究中，也常被作为神经毒性模型应用于外源化合[62][40]物毒性机制的研究中，如纳米粒子、敌草快、甲基苯丙胺等。Zhang等用0、5、10、50、100及200μM的PFOS处理小胶质细胞N9细胞48h，结果显示N9细胞[63]的存活率随PFOS剂量的增高而降低。Chen等将SH-SY5Y细胞暴露于0、5、25、50、100μM的PFOS，48h后发现，当PFOS浓度达25μM时，细胞存活率显著降低并出现明显凋亡。因此，本研究中我们选用0、10、50、100、150、200μM的PFOS来处理SH-SY5Y细胞，48h后MTT法检测各处理组细胞存活率分别为102.4%、76.9%、55.15%、37.84%、21.90%。与对照组相比，在50-200μM处理组细胞存活率降低，细胞活力受到明显抑制(P<0.05)。同时形态学结果显示，10μMPFOS处理组细胞形态与对照组无差别，而50μM-200μMPFOS处理后细胞形态则随剂量的增加开始出现明显的细胞胞体变小、边界不清、圆形细胞增多以及突起收缩断裂等现象，说明PFOS对SH-SY5Y细胞造成了损伤。这与上述报道的研究结果相一致，可以认为本研究构建的PFOS体外神经毒性模型合理可行。文献报道，脑外伤、低血糖、脑缺血及缺氧能够明显影响BDNF及TrkB的表达，影响ERK和PI3K信号通路的激活，减少CREB表达或降低其磷酸化水平，从[64]而导致Bcl-2表达水平的降低及Bax表达水平的升高，诱导神经细胞凋亡。而相[31]应外源性的补给或激活BDNF等基因，则可以减少神经元所受损伤。根据MTT实验结果显示，150、200μM的PFOS处理SH-SY5Y细胞48h后，细胞存活率低于50%。为探讨PFOS神经毒性的可能机制，后续研究中我们均选用0、10、50、100μM的PFOS来处理SH-SY5Y细胞。本部分研究结果显示，PFOS降低了BDNFmRNA表达水平及蛋白浓度，并下调了CREB蛋白表达水平，且下降趋势存在剂量反应31 关系。而随着BDNF表达的降低，TrkB在10以及50μM处理组出现了升高，在100μM处理组则显著性降低。作为BDNF特异性受体TrkB，先增加后降低的表达趋势可[65]能是一种代偿反应，也可能是PFOS神经毒性的非线性效应。另外，本研究结果显示，PFOS降低了SH-SY5Y细胞内CREB蛋白表达水平的同时而升高了p-CREB蛋白表达水平，且p-CREB与CREB之比随PFOS浓度的增加2+呈上升趋势。这可能与PFOS引起了钙稳态失调有关。Ca作为细胞内的第二信使，与维持细胞膜两侧的生物电位、肌肉伸缩、基因转录以及神经传导等密切相[65]关。研究表明，PFOS可激活N-甲基-D-天冬氨酸受体调控的门控通道；也能够2+[66]2+2+诱导L-型Ca钙离子通道开放，从而引起Ca内流，使细胞内Ca超载，导致钙紊乱。而长时间的PFOS暴露在增加内钙浓度的同时，也影响了神经元的发育[67]2+2+以及突触的形成，严重时还可引起细胞死亡。Ca可与Ca感受器钙调蛋白2+（Calmodulin，CaM）结合形成Ca-CaM，活化下游的蛋白激酶如CaMK，从而激活下游基因CREB。钙调蛋白依赖性激酶（Calmodulin-dependentproteinkinaseII，CaMKII)作为CaMK的一种亚型参与调节神经细胞的多种功能，如神经元发[68]育、LTP形成等。文献报道，神经元中CaMKII的适量表达对学习记忆的维持有重要作用，但其表达过度则与一些外源性化合物所致的神经毒性作用及退行性[69][70]神经病变有关。Johansson等给予新出生10天的小鼠PFOS单次口服暴露，24h[71]后检测发现小鼠海马中CaMKII以及GAP-43的表达水平显著增加。Liu等的研究也显示，PFOS能够显著升高大鼠海马中CaMKII的蛋白表达水平。因此，我们推测本实验中PFOS引起的CREB磷酸化水平升高，可能与PFOS诱导了神经细胞2+的Ca内流，过度激活CaMKII有关。3.6小结PFOS暴露能降低SH-SY5Y细胞的活性，改变BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因的表达水平。32 第4章结论4.1围产期PFOS暴露造成的子代小鼠海马组织损伤，与BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因表达的下降及突触相关蛋白表达降低有关；4.2PFOS暴露能降低SH-SY5Y细胞活性，改变BDNF/TrkB/CREB信号通路关键基因的表达水平；4.3PFOS干扰神经细胞的BDNF/TrkB/CREB信号通路，这可能是PFOS神经毒性的机制之一。33 34 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文献综述全氟辛烷磺酸盐神经发育毒性研究进展孙诗博综述曾怀才审校摘要：全氟辛烷磺酸盐(Perfluorooctanesulfonates,PFOS)作为一种具有持久性、生物蓄积性、远距离环境迁移等特性的典型全氟化合物(PerfluorinatedCompounds,PFCs)，其所带来的全球性污染问题已引起广泛关注。近年来，研究者们发现PFOS除具有心血管、肝脏、肺脏、免疫及生殖毒性外，还存在神经发育毒性。本文以近年来国内外PFOS相关研究资料为基础，对其在生物体中的神经发育毒性进行综述。关键词：全氟辛烷磺酸盐；神经发育毒性；效应；机制ResearchProgressinDevelopmentalNeurotoxicityofPFOSAbstract:AsaclassicPerfluorinatedCompounds(PFCs),Perfluorooctanesulfonates(PFOS)ischaracterizedbypersistence,bioaccumulationandenvironmentmigratory,theproblemsofgloballypollutionhasarousedwidespreadconcern.Inrecentyears,thestudieshaveshownthatPFOShastoxicityofcardiac,liver,lung,immune,reproductive,inadditiontodevelopmentalneurotoxicity.Inthisreview,wesummarizestherecentlyinternationalresearchondevelopmentalneurotoxicityofPFOS,andprovidessomeideasforfurtherresearches.Keywords:PFOSdevelopmentalneurotoxicitytoxicitytoxicitymechanism全氟辛烷磺酸盐(PFOS)是全氟化合物(PFCs)的代表物质之一，也是多种PFCs降解后的产物，1951年由美国3M公司率先研制。其分子是17个氟原子及8个碳原子所构成的烃链，烃链末端带有一个磺酸基团，烃链上的C-F共价键键能约为460kJ/mol，这种结构使得PFOS具有良好的化学稳定性。同时其有高疏油疏水性，被广泛应用于消防泡沫、涂料、润滑剂、农药、纺织品、皮革及造纸[1]等诸多工业生产和日用品中。PFOS的这些化学特性，使其不易降解。近年来[2,3]越来越多的研究发现，PFOS广泛存在于多种环境介质及生物体内，包括北极圈的一些动物乃至人体中。更有研究者发现，PFOS不但能够在生物体中富集而43 [4]且可以通过食物链放大。由于PFOS的应用范围广，用量较大，其对环境的危害也日益被人们正视。2006年10月欧盟出台了PFOS禁令，2009年PFOS被列入《关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约》。[5]PFOS在人类体内的半衰期有5.4年，大量研究发现其能够蓄积于生物体的多个器官与组织，引发肝脏、肺、心血管、免疫、生殖及神经毒性。研究显示无论是孕期还是哺乳期PFOS暴露，均能使子代产生认知及行为功能障碍，学习和[6,7]空间记忆能力异常。这个发现也证明了PFOS可以通过胎盘及血脑屏障，能通[8][9]过乳汁从母体向子代转移，蓄积于子代的脑组织中，损伤其神经系统。由于发育中的神经系统更为敏感性，所遭受的损害更持久且不可逆，因此PFOS带来的神经发育毒性备受关注。但目前造成这种神经毒性的机制尚不明确。本文总结近年来PFOS神经发育毒性研究的进展，重点探讨PFOS在大脑中的蓄积状况、神经发育毒性效应和可能的作用机制,并展望今后的研究方向。1PFOS在大脑中的蓄积状况目前，PFOS已在多种生物的多个器官与组织中发现，其中蓄积量以肝脏、[10][11]血液、肾脏及脑组织中较高。Maestri等运用液相色谱串联四级杆质谱法检测到PFOS在人脑中的含量为1.3ng/gw.w.，这相当于血清中的32%，肝脏中的[12]10%。Pérez等对20份人体组织进行尸检发现PFOS在脑中的平均浓度为4.9ng/gw.w.，中位数为1.9ng/gw.w.，在肾脏中的浓度为75.6ng/gw.w.，中位数为55ng/g[13]w.w.，但在骨骼中未检出。Greaves等对格陵兰岛的115份北极熊大脑样本进行分析，检测发现脑中PFOS的平均浓度为35.2±2.0ng/gw.w.，各脑区中下丘脑的PFOS含量最高。在其他不同野生动物中，PFOS在生物体内也有类似的分布特征（见表1）。表1PFOS在不同野生动物大脑、肝脏、血液、肌肉中的蓄积水平（单位：ng/gw.w.）物种大脑肝脏血液肌肉参考文献[14]银鸥4.483.932.79.1Gebbink等[15]鹈鹕3.536.7—0.8Oliveiro-Verbel等[16]海豹99±491017±536349±37059+52Ahrens等[17]鼠海豚24±23327±351—41±50Kristin等[18]北极熊35.2±2.03270±290128±1715.9±1.7Greaves等[19]还有一些研究者将动物暴露于PFOS来研究其在体内的蓄积情况。Stao等44 以0-128ppm的浓度连续暴露于大鼠13周，结果表明随着PFOS剂量的增加，其在[20]血液、脑、肝脏及肾脏中的蓄积量呈上升趋势。Borg等将GD16期母鼠单次暴露于35S标记的PFOS，收集母鼠及其子代的血液、肝脏、大脑等组织，检测发现，与母鼠比较，PFOS在仔鼠大脑、血液中含量分别是母鼠的3.8-5.4倍和1.1-2.3倍，[21][22]而PFOS在仔鼠肝脏中含量较母鼠低1.7倍。Chang等及Onishchenko等的动物实验结果与之类似。[23]另外有研究对人体的样本进行了进一步分析，Harada等通过检测人脑脊[24]液、血清和胆汁中的含量，发现中枢神经系统是PFOS的毒性靶器官。Javins等对比妊娠前及妊娠期各阶段孕妇血液中的PFOS浓度，结果显示孕期第九个月妇[25]女的血液中PFOS含量低于妊娠前。Mondal等以4943对母子/女（儿童年龄1-19岁）血清中PFOS浓度为研究对象，检测后发现PFOS在孩子血清中的浓度往往都高于母亲。这些研究表明，PFOS能够蓄积于脑组织，其可能是透过血脑屏障达到大脑、通过胎盘屏障影响子代的。2PFOS神经发育毒性效应近年来，国内外学者逐渐发现PFOS能造成多种神经发育毒性效应，主要涉及神经系统发育、运动行为与功能、认知及学习记忆能力等。2.1PFOS对神经系统发育的影响[26]研究发现，PFOS暴露可能会影响2岁儿童的粗大运动发育，还能引起低龄[27][28]啮齿类动物神经系统发育迟缓。Peden-Adams等发现，PFOS暴露能使白来[29]航鸡大脑发育不对称的概率增加，并可导致实验动物出现脑水肿。王昕等用0.1及10mg/kg的PFOS连续14天腹腔注射Wistar成年雄性大鼠，发现10mg/kg组大鼠出现以单眼眼裂及瞳孔变小、身体向单侧倾倒、提尾倒立实验身体向对侧弯曲及前[30]肢下垂为特征的偏瘫体征。Zhang等研究发现，PFOS暴露能造成斑马鱼胚胎畸形，包括脑坏死、胚胎溶解、脊柱侧弯等。2.2PFOS对运动行为与功能的影响一些研究表明，PFOS可使生物体运动度增强、行为功能出现异常。相关横[31][19]断面研究显示，儿童注意多动缺陷障碍可能与PFOS暴露有关。Stao等分别将大鼠和小鼠单次暴露于PFOS，观察发现250mg/kg组大鼠和150mg/kg小鼠组出45 [27]现惊厥症状。Johansson等将NMRI雄性小鼠单次暴露于0.75及11.3mg/kg的PFOS，2和4个月后观察小鼠，发现暴露组自发性行为受到影响，主要表现为活[9]动过度和习惯化行为减少，并随着时间的增长该影响越加严重。Butenhoff等将GD0期大鼠暴露于PFOS，观察发现0.3和1.0mg/kg暴露组PND17的雄性子代及[32]1.0mg/kg的PND21雌性子代自发性活动与对照组相比明显增加。Wang等将受精后8h的斑马鱼胚胎暴露于0-50μg/L的PFOS，发现暴露组比对照组斑马鱼游速[33]更快。夏继刚等用0.1、1、10mg/L的PFOS暴露受精后4h的斑马鱼胚胎，观察发现暴露于10mg/LPFOS6dpf及9dpf的仔鱼最大持续运动距离显著增加，异常行[34]为明显。Huang等将6dpf的斑马鱼幼体暴露于0-4mg/L的PFOS，1h后观察其游[35]动情况，结果显示随着PFOS的浓度升高其游动程度更加活跃。Spulber等的研究也证实了这一点。另有研究者发现PFOS暴露能引起实验动物行为能力障碍或活动水平降低。[36]Luebker等分别将不同时期的雌、雄大鼠暴露于0-3.2mg/kg的PFOS42天，观察发现0.4及1.6mg/kg组的F1代子鼠出现了睁眼延迟，1.6mg/kg组的F1代子鼠平面翻[22]正及空中翻正反应迟缓。Onishchenko等以0.3mg/kg的PFOS暴露于GD1期小鼠至妊娠期结束，结果显示PFOS暴露能使子代雄性小鼠探索性活动减少，肌力下[29][37]降。并伴一定程度的精神烦躁。Xia等用浓度为0-32mg/L的PFOS急性暴露于金鱼幼体，48小时后发现随着PFOS剂量的升高，其运动距离减少而静止时间增[38]加。Chen等将秀丽隐杆线虫暴露于PFOS，48h后发现20mM暴露组线虫出现以[39]正向运动频率下降、头部划水率降低为主的自发性行为减少。VanGossum等的研究表明，PFOS暴露能降低豆娘幼虫的活动水平并呈剂量反应关系，同时[33]PFOS能使其觅食成功率及躲避捕食者的能力降低。这与夏继刚等在斑马鱼仔鱼0-1mg/LPFOS暴露实验中，9dpf观察到的结果一致。2.3PFOS对认知及学习记忆能力的影响目前研究者们在PFOS对学习记忆及认知水平影响程度的研究结论尚未达成[40]一致。Long等以0.43、2.15、10.75mg/kg的PFOS连续处理3月龄的C57BL6小鼠90天，水迷宫实验显示，2.15、10.75mg/kg暴露组的逃避潜伏期较对照组显著延[41]长。Fuentes等对GD12-18天的母鼠进行0、6mg/kg/d的PFOS灌胃染毒，取3月[42]龄小鼠观察到其空间记忆能力受损，并存在一定的性别差异。陈娜等以5、20、46 40mg/kg的PFOS腹腔注射2月龄雄性ICR小鼠，在PFOS较高暴露组也有相似的发现。这些结果表明高剂量PFOS能使小鼠记忆保持能力下降，空间学习记忆受损。[43]Pinkas等用5、10mg/kg的PFOS处理受精后的鸡卵，观察发现孵化后的小鸡印[38]记行为受损。Chen等通过趋化性检测发现PFOS暴露后的秀丽隐杆线虫趋化学[44]习能力下降。Fuentes等将3月龄的成年雄性小鼠连续4周灌胃暴露于0、3、6mg/kg/d的PFOS，通过FOB及旷场实验来评估它们运动、感觉功能及探索行为，观察发现仅旷场实验3、6mg/kg/d组小鼠的行为受到轻微影响；通过水迷宫实验评价其学习及记忆功能，观察显示仅3mg/kg/d组小鼠产生了空间记忆障碍。Lau[45]等用3mg/kg的PFOS暴露GD2期大鼠至GD21期，观察PND21幼鼠在T形迷宫测[36]试中的反应，结果未见暴露组与对照组幼鼠在行为表现上存在差异。Luebker等也发现，大鼠PFOS暴露后，各组F1子代在被动回避反应及水迷宫试验中表现无差异，这说明PFOS对幼鼠在学习、记忆等方面没有显著影响。3PFOS神经发育毒性机制3.1诱导氧化应激与细胞凋亡氧化应激是指细胞受到内外环境刺激后，体内高活性分子，如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多，使机体氧化与抗氧化系统之间失衡，从[38]而导致细胞凋亡或组织损伤。Chen等通过体外实验发现，PFOS暴露能引起细胞内ROS水平显著增加并导致SH-SY5Y细胞出现凋亡，同时随PFOS浓度的升高，GSH水平降低，而MDA与SOD水平增高。用N-乙酰半胱氨酸预处理细胞后能够阻断PFOS介导的ROS生成，并抑制SH-SY5Y细胞凋亡，这表明细胞内的ROS是[30]PFOS致SH-SY5Y细胞凋亡的重要因素。Zhang等的研究认为PFOS可能通过激活CDK5活化p53，导致神经细胞凋亡及幼鱼的脑坏死。还有研究显示PFOS导致[44]啮齿类动物的空间学习记忆能力缺陷，与动物的海马区受损有关，这种损伤可[42]能是海马区神经元的细微形态改变也可能是该区域的细胞凋亡造成的。Long[40]等研究发现PFOS长时间暴露能引起Caspase-3上调和BCL-2、BCL-XL及生存素下降，导致成年小鼠海马神经细胞凋亡，从而使海马组织病变引发空间学习记忆障碍。3.2影响血脑屏障血脑屏障是血液与脑组织间的一种特殊屏障,可以选择性地限制某些物质47 由血液进入脑组织。由毛细血管的内皮、基膜和星形胶质细胞的血管周足等构成。其中内皮细胞是构成血脑屏障的主要结构。大量实验证明，PFOS能够透过血脑屏障进入大脑，其蓄积于胎鼠及幼鼠脑组织中可能与它们血脑屏障的不成熟有关[46][47]。Wang等发现PFOS引起的血脑屏障通透性增强，可能与激活PI3K/Akt信号通路引发细胞紧密连接中断有关，也可能是细胞骨架微管的核聚集导致细胞[29]微丝重排所造成的。3.3干扰钙信号转导钙离子，作为信号转导通路中的重要信使，与突触发生、神经递质合成与释放及突触可塑性调控密切相关，对神经系统的发育及功能有重要作用。外界刺激2+[48]能使细胞外Ca涌入细胞内，造成细胞损伤，影响细胞功能。刘晓晖等将雄性成年大鼠饲喂暴露于2、8、32、128mg/kg的PFOS，检测发现大鼠脑组织中PFOS2+[49]浓度、海马中Ca浓度随PFOS剂量的增加而升高。Liao等发现PFOS急性灌注大鼠脑片能够引起L-型钙通道介导的内向钙电流增加，诱导mPSCs频率和振幅增[50]强。Liu等将妊娠期大鼠暴露于3.2mg/kgPFOS，研究显示PFOS能够增加NR2B、CAM、CaMKIIα及CREB的表达，使钙信号转导系统紊乱，引发神经毒性。3.4影响神经递质释放神经递质是在突触传递中是担当“信使”的特定化学物质。主要分为四类，即生物原胺类、氨基酸类、肽类、其它类等。其中多巴胺及谷氨酸分别是生物源胺[35]类和氨基酸类的代表物之一。Spulber等将斑马鱼胚胎暴露于1mg/L的PFOS，于6dpf观察其活动情况，结果发现其自发性活动增强可能与PFOS暴露引起了神[51]经系统多巴胺缺乏有关。王珂等的研究显示，PFOS引起了PKC、PKA活性增高并损伤脑皮质细胞的超微结构。一些研究结果表明PFOS能够显著影响外源性[49][40]谷氨酸激活电流，使内源性谷氨酸异常增加，而随着谷氨酸的释放增多，其兴奋毒性作用会损伤脑组织。3.5影响突触形成及突触可塑性突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。突[2]触形成及突触可塑性与神经系统发育和学习记忆功能构成密切相关。Zeng等将SD大鼠暴露于0.1、0.6和2.0mg/kg的PFOS，检测发现子代海马突触超微结构[3]损伤，突触小泡相关蛋白表达降低。Zeng等还发现PFOS暴露后，子代大鼠海48 马组织及脑皮质中星形胶质细胞的活化标志物GFAP及S-100β表达升高，并伴随[4]IL-1β及TNF-α表达增加，而突触蛋白1和突触素蛋白表达下降。王法琦等将GD0期Wistar大鼠暴露于3.2mg/kgPFOS，采用miRNA芯片技术检测PND1及PND7子鼠脑皮质miRNA谱，结果显示参与长时程突触可塑性相关蛋白基因调控的miR-466b、miR-672、miR-297、miR-674-3p和miR-207差异性表达显著，这说明PFOS对突触发生及突触可塑性的危害可能与miRNA的改变有关。4展望PFOS作为一种新型持久性环境污染物，已引起越来越多研究者的关注。近年来，其神经发育毒性研究已取得了一些成果，但仍存在有待加强的方面。4.1PFOS神经发育毒性效应的研究大多仍局限于实验室中，往往实验设计的剂量无法代替环境相关剂量，这造成效应研究的结果无法统一，同时也难以将实验结果外推至人类。因此，在环境相关浓度下对PFOS神经发育毒性进行评估显得尤为必要；4.2目前，对于PFOS神经毒性发育机制探讨仍集中于以上几个方面，但随着近几年表观遗传学的发展，有研究表明一些环境污染物能够通过改变基因的表观遗[55,56]传学状态，影响基因的表达，从而造成组织损伤或影响神经系统功能。这一成果为PFOS神经发育毒性机制的探讨提供了新的切入点。因此，研究表观遗传学效应在PFOS神经发育毒性中的作用将是未来研究的又一方向。49 参考文献[1]PaulAG,JonesKC,SweetmanAJ.Afirstglobalproduction,emission,andenvironmentalinventoryforperfluorooctanesulfonate[J].Environmentalscience&technology,2009,43(2):386-392.[2]TaniyasuS,KannanK,HoriiY,etal.Asurveyofperfluorooctanesulfonateandrelatedperfluorinatedorganiccompoundsinwater,fish,birds,andhumansfromJapan[J].Environmentalscience&technology,2003,37(12):2634-2639.[3]GreavesAK,LetcherRJ.Linearandbranchedperfluorooctanesulfonate(PFOS)isomerpatternsdifferamongseveraltissuesandbloodofpolarbears[J].Chemosphere,2013,93(3):574-580.[4]TomyGT,PleskachK,FergusonSH,etal.TrophodynamicsofsomePFCsandBFRsinawesternCanadianArcticmarinefoodweb[J].Environmentalscience&technology,2009,43(11):4076-4081.[5]OlsenGW,MairDC,ChurchTR,etal.DeclineinperfluorooctanesulfonateandotherpolyfluoroalkylchemicalsinAmericanRedCrossadultblooddonors,2000-2006[J].Environmentalscience&technology,2008,42(13):4989-4995.[6]FuentesS,ColominaMT,VicensP,etal.Influenceofmaternalrestraintstressonthelong-lastingeffectsinducedbyprenatalexposuretoperfluorooctanesulfonate(PFOS)inmice[J].Toxicologyletters,2007,171(3):162-170.[7]刘利,金一和,王烈,等.全氟辛烷磺酸对大鼠仔鼠学习记忆能力的影响[J].中华预防医学杂志,2009,43(7):622-627.[8]SoMK,YamashitaN,TaniyasuS,etal.HealthrisksininfantsassociatedwithexposuretoperfluorinatedcompoundsinhumanbreastmilkfromZhoushan,China[J].Environmentalscience&technology,2006,40(9):2924-2929.[9]ButenhoffJL,EhresmanDJ,ChangSC,etal.Gestationalandlactationalexposuretopotassiumperfluorooctanesulfonate(K+PFOS)inrats:Developmentalneurotoxicity[J].ReprodToxicol,2009,27(3-4):319-330.[10]ShiY,WangJ,PanY,etal.Tissuedistributionofperfluorinatedcompoundsinfarmedfreshwaterfishandhumanexposurebyconsumption[J].Environmentaltoxicologyandchemistry/SETAC,2012,31(4):717-723.[11]MaestriL,NegriS,FerrariM,etal.Determinationofperfluorooctanoicacidandperfluorooctanesulfonateinhumantissuesbyliquidchromatography/single50 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主要英文缩略语（按英文字母排序）英文缩写英文全称中文全称BDNFBrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经营养因子CaMCalmodulin钙调蛋白CaMKⅡCalmodulin-dependentproteinkinaseⅡ钙调蛋白依赖性激酶ⅡCREcAMPresponseelementcAMP效应元件CREBcAMP-responseelementbindingproteincAMP反应元件结合蛋白LTPLong-termpotentiation长时程增强NTFsNeurotrophicfactors神经营养因子p-CREBPhosphorylationcAMP-responseelement磷酸化cAMP反应元件bindingprotein结合蛋白PBSPhosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液PFCsPerfluorinatedchemicals全氟化合物PFOSPerfluorooctanesulfonate全氟辛烷磺酸盐POPsPersistentOrganicPollutants环境持久性有机污染物SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠SDS-Sodiumodecylpolyacrylamide十二烷基硫酸钠一聚丙PAGEelectrophoresissulphategel烯酞胺凝胶电泳Syn1Synapsin1突触蛋白1SypSynaptophysin突触囊泡蛋白TEMEDN,N,N',N'-tetramethylethylenediamineN,N,N'N'-四甲基乙二胺TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷TrkBTyrosinekinasereceptorB酪氨酸激酶受体B55 作者攻读学位期间的科研成果一、科研论文1、孙诗博,李武,潘小元,林鑫,曾怀才.PFOS对斑马鱼胚胎发育及SOD、MDA和GSH含量的影响[J].实用预防医学,2015,22(6):648-651；2、曾怀才,孙诗博,李武.BDNF/TrkB/CREB信号通路介导PFOS的神经发育毒性[A].中国毒理学会第四届中青年学者科技论坛论文集[C].2014；3、曾怀才,孙诗博,李武,吴移谋.线粒体凋亡途径介导孕期全氟辛烷磺酸盐暴露致子鼠心脏细胞的凋亡效应[A].中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C].2013二、在读期间参与的科研项目1、国家自然科学基金项目：CREB/BDNF信号通路关键基因表观遗传修饰在PFOS神经发育毒性中的作用及机制（81172712），2013-2016；2、湖南省自然科学基金项目：BDNF基因甲基化修饰在生命早期PFOS暴露致记忆损伤中的作用（12JJ3098），2012-2014；3、湖南省科技厅科研项目：CREB/BDNF信号通路表观修饰在PFOS诱导神经发育毒性中的作用（2012RS4010），2012-201356 致谢时光荏苒，转眼间时钟的脚步临近了2015年的夏天。回首研究生的三年，喜悦交杂失落、付出伴着收获。值此毕业之际，衷心的向给予我指引、帮助以及关心的人们致以感谢。感谢我的导师曾怀才副教授，在我遇到困难时给予的帮助和指导、在实验失利时给予的鼓励和包容、在论文写作中给予的意见和建议，让我在这三年对科研有了进一步的认识，科研能力得到了锻炼，也让我更深刻的认识到那些实验阶段的痛苦和挫折其实也是塑造独立、坚强性格的一种磨练。感谢使我与南华结缘的何淑雅教授，三年前只因我的调剂申请，您便给予了素不相识的我悉心关怀与帮助，让我有机会开启研究生的旅程。感谢让蔚清教授、龙鼎新教授、陈锋教授、贺性鹏教授、张朝晖副教授、黄波副教授、龙斌老师、郝玉娥老师、谭琰老师、王婧老师在三年中给对我关心和帮助。感谢魏传杰、李涛、曾灿、肖双等师兄师姐在实验技术方面给予的支持与指导；感谢李躲、曹金秀、范美婷、李名慧、胡立丹、刘玲、阳静、赵维超、赵琳、吴铁钢、夏利华等同学在这三年科研及生活中的分享和鼓励、安慰与帮助，衷心祝愿他们前程似锦、鹏路翱翔。最后，衷心的感谢我的家人，三年中给予我的包容和理解，也感谢他们的支持与付出。57