低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究

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1、第４１卷第６期工业微生物Vol．４１No．６２０１１年１２月IndustrialMicrobiologyDec．２０１１doi：１０．３９６９桙j．issn．１００１－６６７８．２０１１．０６．０１６低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究倡王培培，刘晓宁，林国秀，李珍，唐瑗�，张杰（四川大学生命科学学院，四川成都６１００６４）摘要：利用含有Tween８０的琼脂平板和摇瓶发酵法，从若尔盖高原土壤中筛选产脂肪酶菌株。通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定，得到一株产低温脂肪酶的适冷菌Pseudomonassp．DL－B，并设计正交试验对该菌株的产酶发酵培养条件进行

2、了优化。摇瓶实验表明，该菌株最适产酶发酵培养基为：蔗糖１０g桙L，蛋白胨２０g桙L，猪油１０mL桙L，MgSO４·７H２O０．５g桙L，K２HPO４１g桙L，Tween８０５mL桙L；培养条件：２５０mL锥形瓶中装液量４０mL，温度３５℃，初始pH值为７．０。酶活性可达１２３４．２３U桙mL，为优化前的２．７倍。对其酶学特性进行初步研究表明，其最适作用pH值为９．０，最适作用温度为２５℃，有一定的热稳定性。关键词：低温脂肪酶；碱性脂肪酶；筛选；发酵条件；酶学性质脂肪酶（Lipase，EC３．１．１．３，甘油酯水解酶）又化活性，是在研究和应用上进展最快的洗涤剂用酶，称三酰基甘

3、油酰基水解酶。它的出现最早可以追溯它有利于脂肪油渍和人体皮脂污垢的去除，有明显［７］到１９０１年，EijkmanC．Uber等人从粘质沙雷（氏）的助洗作用。国外早在１９８８开始就报道了碱性菌，铜绿假单胞菌中分别发现了脂肪酶，这也是目前脂肪酶在洗涤剂中的应用，并将其投入了工业化生研究的最好的几株产脂肪酶菌株。对能够水解甘油产。相形之下，国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，三酸酯的酶的研究已有三百多年的历史，对脂肪酶在酶的品种、活性、酶颗粒制备技术等方面与国外［１］水解和合成酯类物质的研究也有８０多年的历史。有较大差距。脂肪酶可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸本文从地处青藏高原

4、东缘的川西北草原土壤中（其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、分离得到了一株产低温碱性脂肪酶的中温菌，用正甘油和游离脂肪酸），也能催化酯化反应———水解反交试验法优化了其产酶发酵条件，并对粗酶的酶学应的逆反应。目前，脂肪酶在食品、轻纺、皮革、香性质进行研究。与目前已报道的脂肪酶相比，在低［２－３］料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等众多领域温下有较好的酶活性，最适pH为９．０，开发应用前都有应用，是一类重要的工业用酶。景理想。脂肪酶中最适作用温度在３０℃左右而在０℃［４］1材料与方法左右仍有一定催化效率的酶称为低温酶，其特点是低温下具有高催化活性，耐有机溶剂以及对热敏

5、1．1材料［５］感等。由于以上特点，低温脂肪酶在食品、洗涤、1．1．1菌种制药、脂类加工、低温环境修复等方面有着巨大的应自川西北草原红原县的奶牛场和污水沟等处采用潜力，尤其是在环境修复方面，使用低温脂肪酶将集土样，经过培养、筛选，获得低温菌株。红原县地处［６］对保护环境产生非常积极的意义。“世界屋脊”青藏高原东部边缘，位于四川省西北部、碱性脂肪酶在pH８．０～１０．５的范围内有高催阿坝藏族羌族自治州中部，平均海拔在３６００米以上，基金项目：国家科技支撑计划（批准号：２００７BAC１８B００）；四川省应用基础项目（批准号：２００７J１３－０７７）。作者简介：王培培（１９８６～

6、），女，河南省巩义市，硕士研究生，研究方向为资源微生物，E－mail：w－p．xin．４２３６６４９＠１６３．com。倡通讯作者：张杰，博士，副教授，E－mail：zhangjfy＠１６３．com。万方数据—７８—第６期王培培等：低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究第４１卷年平均气温１．１℃，极端最低气温零下３６．２℃。火１min，７２℃延伸１．５min，３０个循环，７２℃再延1．1．2试剂伸１０min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后交由英p－NPP（对硝基苯棕榈酸酯，p－nitrophenyl-俊生物技术公司进行测序，序列通过GenBank中的palmitate）购

7、自上海阿拉丁试剂公司，其它试剂均为BLAST检索进行同源性分析。选取同源性较高的国产，分析纯。若干种菌株，采用ClustralXversion１．８３进行多序1．1．3仪器列匹配排列，用MEGA４．１构建系统发育树。UV—２４５０紫外分光光度计（SHZMADZU）；冷1．2．3分光光度法测酶活冻高速离心机（eppendorf）；电子恒温水浴锅（北京中用对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物，用１０mL异兴伟业仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海丙醇溶解３０mg对硝基苯棕榈酸酯（简称p－申安医疗机械厂）。NPP），与９０mL