南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究

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1、集萎夫学硕士学位论文南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究■J-●■■一In一_●J_SoIation,ol，t●伽zationofalOW-也m口eratUrephytasefromAntarcticstrainandstudiesonenzymologicalcharacterization论文答辩日期：2Q!垒生鱼且垒旦学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写

2、过的研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人：亏鹂时间：劢悦占·／7保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者：亏码导师：叫黜杏时间：7洲V．6．I甲南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究摘要植酸酶作为一种绿色饲料添加剂，能够有效提高饲料中植酸磷的

3、利用率，降低植酸的抗营养作用，从而降低生产成本，并能够缓解粪磷排泄所造成的环境污染，在饲料行业中已经得到广泛应用。现在应用的植酸酶大多为中高温植酸酶，与低温植酸酶相比它们在低温下活性较低，而单胃动物的生理温度在39。C左右，在水产养殖业中通常需要植酸酶在低于28℃具有较高的催化活性。因此，低温植酸酶具有巨大的潜在应用价值。本研究通过两步筛选法从南极深海沉积物样品中分离出10株产植酸酶菌株，其中一株具有较高的植酸酶活性，命名为JMUYl4。经形态学、生理生化和26SiRNAITS区序列系统发育分析

4、鉴定为红酵母属(Rhodotorulasp．)。据我们所知，这是首次有关红酵母属产植酸酶的报导。采用单因素试验和响应面试验设计相结合的方法对Rhodotorulasp．JMUYl4的产酶条件进行了优化，结果如下：葡萄糖4％，蛋白胨2％，NaN031．5％，KCl0．025％，MgS04"7H20O．025％，MnS04"H200．002％，FeS04-7H200．002％，发酵时间48h，发酵温度25℃，培养基初始pH5．0，接种量10％。通过对单因素试验结果进行分析，选取发酵温度(℃)、接种量

5、(％)和蛋白胨添加量(％)为显著因子进行Box．BehnkenDesign(BBD)，结果如下：在发酵温度26℃，接种量10．4％，蛋白胨添加量2．3％的条件下，植酸酶产量达到205．447U／ml，与软件预测的植酸酶产量201．948U／ml基本一致，比优化前大约提高了3．4倍。通过硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析、SPSepharoseFastFlow阳离子交换层析和SephadexG—loo凝胶过滤层析对Rhodotorulasp．JMUYl4的胞外植酸

6、酶进行了分离纯化，纯化倍数和回收率分别为15．16和5％，植酸酶的比活达到31635U／mg。Rhodotorulasp．JMUYl4的植酸酶具有以下特性：(1)等电点为4-33，分子量为63kDa；(2)最适温度为50℃，在10℃和37℃分别保留17．5％和85％的酶活，表明其在低温下具有较高的活性；在45℃和50℃孵育50min分别保留64．8％和41％的酶活，55℃处理10min、20min、30min、40rain、50min分别保留45．7％、36．2％、22．9％、21．0％、12．

7、4％的酶活，60℃或65℃处理10min酶活基本丧失；(3)最适pH为5．0，在pH2．0．8．0稳定性较好，适于在单胃动物胃肠道中发挥作用；(4)M92+、Fe2+、Fe3+、K十、Na+、Ca2+、EDTA和EGTA能够增强植酸酶的活性；cu2+、Zn2+、Mn2+、A矿、PMSF、Phenylgloxalhydrate和SDS能够抑制植酸酶的活性，其中Phenylgloxalhydrate是组氨酸酸性磷酸酶的特异性抑制剂。因此，Rhodotorulasp．JMUYl4的植酸酶属于组氨酸酸性

8、磷酸酶(HAP)家族；(5)在O．1mg／ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中37。C孵育lh，剩余酶活分别为92．2％和75．6％，表明它具有较强的蛋白酶抗性；(6)植酸酶对植酸的Km和Vmax值分别为0．247mM和0．0265mM／min，对植酸钠的Km和Vmax值分别为0．817mM和O．0218mM／min，表明该植酸酶I对植酸具有较高的亲和力。关键词红酵母属，低温植酸酶，响应面试验设计，植酸酶的分离纯化，酶学性质IIIsolation．ptimizatiofIow-temperatlIso