生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及培养条件研究

《生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及培养条件研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第2o卷第1期茂名学院学报V01．20No．12010年2月JOURNALOFMAOMGUNⅣERSnYFeb．20o9生物柴油脂肪酶产生茵的筛选及培养条件研究韩寒冰，李松佳，沈伟煌，彭翠苹，吴小梅(茂名学院化学与生命科学学院，广东茂名52500o)摘要：从长期被脂肪油脂污染的土壤中分离得到能够以橄榄油为唯一碳源和能源的脂肪酶产生菌，通过在含有演．甲酚紫的培养基培养筛选一株脂肪酶活力最强的菌株，经显微镜观察和生理生化实验，初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillacmegateri-un1)。在pH7．0，橄榄油浓度在812mg／L和以1．5％蛋白胨为氮源的培养条件下三天，脂肪酶

2、的活力最大，达到19．3U／mL。关键词：脂肪酶菌；酶活力；生物柴油中图分类号：Q815文献标识码：A文章编号：1671—6590(2o1O)0l一0012—03生物柴油具有无毒、能生物降解、不含芳香烃且含硫量很低、可以以任意比例与石油柴油混兑的特点。开发生物柴油不仅有利于减小大量进口对我国的能源安全造成的威胁；还对实现经济可持续发展，推进能源替代，减轻环境压力等具有深远的经济与社会效益。酶法制备生物柴油具有化学催化法不可比拟的优越性，是工业化生产的发展方向⋯。生物柴油是由动植物油脂与醇经酯交换反应而得的脂肪酸单烷基酯，最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯。脂肪酶(“pase，EC．

3、3．1．1．3)是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇形成甘油三酸酯酯酶，在催化合成生物柴油的研究中已获得应用【2I3】，但生产中酶的成本过高、甲醇和甘油对酶的毒害作用这两大问题还未能得到根本性的解决，使得生物酶法一直不能在工业生产上得到推广应用。因此，通过筛选或是利用基因工程技术对现有的脂肪酶产生菌进行改造，以获取催化活性更高、对短链醇耐受能力更强的脂肪酶，深入研究脂肪酶的固定化方法和研究影响脂肪酶活性的条件，为实现工业化生产提供依据。1材料与方法1．1菌种所用菌种来源于长期被脂肪油脂污染的土壤。1．2主要培养基【4分离培养基：无机盐培养基1000mL，橄榄油10mL。平板筛选培

4、养基：无机盐培养基960mL，橄榄油与聚乙烯醇(2％水溶液)以l：3的混合乳化液40mL，溴甲酚。发酵培养基：黄豆粉30g，蔗糖5g，蛋白胨15g，Kn2PO41．5g，MgSO,·7H2OO．75g，(NH4)2SO．3．75g，橄榄油10rnl，pH值7．0。1．3方法1)脂肪酶产生菌的分离筛选和纯化。含菌种土壤水溶液在30~C，180r／min恒温摇床培养3天，再用稀释平板法进行分离，取0．1ml稀释液涂布于蛋白胨培养基上培养48h，待平板长出菌落后选择单一菌落，重新转接到以橄榄油作为唯一碳源的筛选培养基中，摇床培养7296h，培养液变混浊后，用分离培养基培养出单菌落保

5、存。2)脂肪酶产生菌株的初步鉴定。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)】对分离到的菌株进行了形态观收稿日期．'2009—10—10；修回日期．'2009—11—28基金项目：茂名学院科学研究基金(203265)作者简介：韩寒冰(1964一)，女，广东廉江人，硕士，副教授，主要从事生物降解研究。第1期韩寒冰等：生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及培养条件研究l3察和生理生化试验，对此菌进行初步鉴定。3)脂肪酶活力测定。取分离纯化菌种培养在30％，180r／min摇瓶培养3d，将培养液过滤并低温离心，取上清液，硫酸铵沉淀法获得粗脂肪酶。脂肪酶活力测定参考橄榄油乳化法l6】。一个单位脂肪酶的

6、定义是：每分钟释放lt~rnol脂肪酸所需脂肪酶的数量。4)影响脂肪酶活力的因素研究。分别选取不同的pH值、橄榄油浓度、氮源条件作为研究对象，在30℃、180r·min的恒温摇床中振荡培养3d测脂肪酸量确定优化培养条件。5)固定化脂肪酶的催化转酯反应。以硅藻土为载体，吸附法制备固定化酶。转酯反应体系：6ml正己烷，0．02mmol三油酸甘油酯，0．06retool甲醇，2．0g固定化脂肪酶粗酶。分三次添加甲醇，37℃、180r／min密闭振荡30h。2结果与分析2．1筛选平板菌落和镜检结果经过二次初筛，分离得一种白色的菌落，如图1，通过革兰氏染色，显微镜观察，结果如图2。图1

7、产脂肪酶茵茵落图图2产脂肪酶菌革兰氏染色显微形态函菌落和菌体形态特征：杆状，末端圆，单个或呈短链排列，直径为1．2—1．5×2．0—4．0微米；生理特征：革兰氏阳性菌及好氧菌，液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。综合形态和生理特征分析，初步鉴定为巨大芽孢杆菌。2．2初始pH值对脂肪酶活力的影晌酸碱度对菌株的生长和酶活力的影响很大，通常细菌适宜于中性的pH值。本实验研究初始pH值在5．5～8．0之间对酶活力的影响。由图3可知，培养基初始pH值为7．0时酶活力最高，故培养基的初始pH值采用7．0。2