油污土壤中脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化

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1、油污土壤中脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化曲威，邵蕾，宋丽芬，徐榕雪（中国农业大学烟台研究院，山东烟台２６４６７０）摘要：为了获得脂肪酶产生菌，进而获得高酶活菌株，试验采集东营胜利油田被废油长期污染的土壤，通过罗丹明Ｂ平板法进行菌株分离筛选，并采用橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活。经１６ＳｒＲＮＡ鉴定，确定为铜绿假单胞菌属，命名为ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳ８。并对该菌株的摇床培养产酶条件进行了初步研究，采用单因素试验和正交试验对Ｓ８菌株产脂肪酶的条件进行优化，得到最佳发酵培养基与条件为葡萄糖８ｇ

2、／Ｌ，酵母粉８ｇ／Ｌ，硫酸铵６ｇ／Ｌ，花生油２０ｇ／Ｌ，起始ｐＨ７．０，接种量９％，温度３０℃，发酵培养时间７２ｈ，为工业化生产提供了出发菌株。..关键词：脂肪酶；铜绿假单胞菌；筛选；鉴定；优化中图分类号：ＴＱ９２５＋．６；Ｑ５５６＋．１文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）１６－４００２－０５ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０４４收稿日期：２０１４－１２－１６基金项目：中国农业大学烟台研究院科研基金项目（ＹＴ２０１１０２）简介：曲威（１９８２－）

3、，女（满族），辽宁抚顺人，助理研究员，博士，主要从事微生物资源研究，（）１３８５３５５５１３３（电子信箱）ｑｕｗｅｉ０５０６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；通信，徐榕雪（１９８２－），女，山东烟台人，助理研究员，博士，主要从事生物资源研究，（电子信箱）ｘｕｒｏｎｇｘｕｅ１９８２＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ。脂肪酶（ｌｉｐａｓｅ，ＥＣ３．１．１．３）是一类广泛存在于微生物和动植物细胞中的水解酶，能在油水界面催化甘油三酯生成甘油及脂肪酸［１］，因其在非水相条件下催化反应可逆，可用于催化醇解、酯化和酯交换反应［２］。生物的

4、脂肪酶由于反应条件缓和，对环境污染小，成本低，被广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤和油脂水解等工业领域［３，４］，并且在生物柴油的制备、地沟油的回收利用等方面有不可替代的应用价值［５］。在自然界中，脂肪酶主要存在于动物胰脏、植物种子和微生物中，由于微生物种类多、繁殖快，并且所产生的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，比动物脂肪酶酶解作用的ｐＨ和温度范围更宽［６］，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要。本研究从山东东营胜利油田附近被废油长期污染的土壤中成功筛选出一株产脂肪酶效果较好

5、的菌株，经过鉴定，确定为铜绿假单胞菌，命名为ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳ８，并对其产酶的培养条件进行优化，得到该菌产酶的最佳发酵条件，以期为脂肪酶的生产提供优良酶源。１材料与方法１．１材料土样：采自东营胜利油田被废油严重污染的土壤，共１６份。富集培养基：酵母粉２ｇ／Ｌ，橄榄油１０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。筛选培养基：酵母粉２ｇ/Ｌ，橄榄油乳化液２０ｇ/Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４

6、０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４０．３５ｇ／Ｌ，琼脂２ｇ／Ｌ，罗丹明Ｂ０．００５ｇ／Ｌ（过滤除菌），ｐＨ７．０。橄榄油与聚乙烯醇（体积分数为２％）以１∶３（体积比）的比例混合，搅动乳化５ｍｉｎ，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液［７］。种子培养基：蛋白胨２ｇ／Ｌ，葡萄糖２ｇ／Ｌ，酵母粉２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。发酵培养基：蛋白胨２ｇ／Ｌ，葡萄糖２ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。碳源筛选培养基：酵母粉２ｇ/Ｌ，（

7、ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ/Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４０．３５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０，分别加入蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖作为碳源。氮源筛选培养基：葡萄糖２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ4０．３５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０，分别加入酵母粉、蛋白胨、尿素、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＮＯ３作为氮源。１．２试验方法１．２．１产脂肪酶菌种筛选１）富集培养。每种土样称量５.0ｇ，加入２０ｍＬ无菌水，振荡制成土壤悬液。取每种土壤悬液各５ｍＬ加入装

8、有３０ｍＬ富集培养基的三角瓶中，将三角瓶置于３０℃摇床振荡培养３ｄ。富集3次。２）初筛培养。将过滤灭菌的罗丹明Ｂ加入到已灭菌的初筛培养基中，倒平板。从富集培养的菌液中取1ｍＬ菌液，用去离子水进行系列梯度稀释后涂布在平板中，３０℃培养３ｄ后，在３５０ｎｍ紫外光下观察，产生脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，且这种荧光圈越大，脂肪酶活越高。依据培养平板上形成的荧光圈大小进行菌种筛选。３）复筛培养。挑取初筛培养基上菌落周围变