二氢嘧啶酶产生菌的筛选及发酵条件的研究

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1、二氢嘧啶酶产生菌的筛选及发酵条件的研究药物生物技术1999年第2期第6卷论文作者：李　隽　胡卓逸　蔡　萍单位：中国药科大学生化研究室，南京210009关键词：二氢嘧啶酶；恶臭假单胞菌；对羟基苯海因　　摘　要　通过筛选确定由恶臭假单胞(Pseudomonasputida)D菌产生的二氢嘧啶酶对5-对羟基苯海因的水解能力较强，该产酶菌发酵条件的研究表明酵母膏对产酶十分重要。甲硫乙基海因对二氢嘧啶酶具有强诱导作用。此产酶菌最适培养基组成为(%)：甘油1.0，酵母膏1.0，NaCl0.3，K2HPO4·3H2O0.2，甲硫乙基海因0.1，MgCl2·6H2O0.05，28℃，发酵18h，每m

2、l发酵液酶活力为2.26U。ScreeningofStrainsProducingdihydropyrimidinase　　andFermentationConditions　　liJun,HuZhuoyi,CaiPing(DivisionofBiochemistry,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nangjing210009)　　Abstract　DihydropyrimidinaseinintactcellsofPseudomonasputidaDhashighspecificityfor5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin.Op

3、timumconditionsforgrowthanddihydropyrimidinaseformationofPseudomonasputidaDweredefined:yeastextractisanessentialfactorforenzymeformation.5-Methylthioethylhydantoinwasfoundtobeastrongeffectiveinduceraswell.Suitablemediumconsistsofyeastextract1.0%,glycerol1.0%,K2HPO4·3H2O0.2%,NaCl，0.3%,5-methlyth

4、ioethylhydantoin.0.1%andMgCl2·6H2O0.05%.Whentheorganismwasgrowthat28℃for18h,about2.26units/mlofdihydropyrimidinasewasotained.　　KeyWords　Dihydropyrimidinase,Pseudomonasputida,5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin　　D-氨基酸是制备β-内酰胺类抗生素如羟氨苄青霉素，头孢菌素的重要中间介质。同时，它也是合成多肽类激素，多种农药的中间体［1］。最常见制备的方法有3种，其中最经济的方法应属生物酶法即二

5、氢嘧啶酶水解海因类化合物制备法［2］。　　Eadie等人发现在动植物组织中存在有降解海因类化合物的酶，此种酶能将海因水解成海因酸［3，4］，以后，Wallach和Grisolic又从牛肝中制得此种酶，因能催化二氢尿嘧啶生成N-氨基甲酰-β-丙氨酸，所以命名为二氢嘧啶酶(Dihydropyrimidinase)［EC3.5.2.2］.他们发现二氢嘧啶酶不仅能水解打开二氢嘧啶环，并且还可以水解与二氢嘧啶结构相类似的海因类化合物，所以二氢嘧啶酶又称海因酶(Hydantoinase)［5，6］。　　本文报道5-对羟基苯海因不对称水解生成N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸的二氢嘧啶酶的菌种筛选和发

6、酵条件的研究。　　1　材　料　　1.1　菌种　　共筛选菌种50株，包括10个属，15个种。　　1.2　斜面培养基　　普通琼脂培养基　　1.3　筛选培养基组成(%)　　甘油1.0，酵母膏1.0，K2HPO4·3H2O0.2，NaCl0.3，MgCl2·6H2O0.05;用4mol/LNaOH调pH至7.2～7.4，500ml锥形瓶装50ml液体培养基，热压灭菌30min。　　1.4　试剂　　N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸根据StarkTSmyth［7］制备。海因，甲硫乙基海因，苯海因根据Suzuki［8］，Henze和Speer法制备［9］，对羟基苯海因根据乙醛酸法制备［10］。其余试

7、剂均为市售商品。　　1.5　仪器　　JHZ-82恒温振荡器；GL20A全自动高速冷冻离心机。　　2　方　法　　2.1　培养方法　　接种菌种于斜面培养基，30℃培养24h。每支斜面培养基中加入10ml无菌水制成菌悬液，每50ml液体培养基加入1ml菌悬液，于28℃，170r/min发酵培养18h。取3ml发酵液5000r/min离心10min，弃上清用生理盐水洗涤菌体后，5000r/min离心，收集菌体。　　2.2　酶活力测定：　　采用改进的Cecere法”