水稻twh基因rnai载体构建及遗传转化

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1、水稻TWH基因RNAi载体构建及遗传转化摘要：根据RNAi表达载体的设计原则，以TWH基因为靶基因，将长度253bp目的片段通过正反两个方向插入表达载体pR1301中，构建RNAi表达载体pR1301-TWHo通过根癌农杆菌EHA105介导法将其导入水稻品种武育粳3号，获得34株阳性转基因植株，为进一步深入研究TWH基因功能奠定了基础。关键词：水稻(OryzasativaL.)；TWH基因；RNAi(RNAinterference)；载体构建;遗传转化中图分类号：S511；Q781文献标识码：A文章编号：0439-8114(2012)24—579

2、1-03RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(doub1e-strandedRNA,dsRNA)介导的同源mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默从而产生相应的功能表型的缺失现象，属于转录后的基因沉默现象。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫中被首次发现[1],利用这一技术可以有效、特异性降解靶标基因mRNA,阻止靶标基因的表达，从而研究目标基因的功能。目前，水稻中已有许多利用RNAi技术进行基因功能分析或验证的报道［2—4］。从水稻育种后代材料中发现一个水稻颖壳扭曲突变体，该突变体主要表现为颖壳扭曲变

3、形，子粒充实不饱满［5］。进一步的研究结果表明，该突变体颖壳扭曲性状受一对隐性基因控制，其对应的TWH基因被精细定位在第二染色体的SSR标记RML25和RML35之间，两个SSR标记间的物理距离为11.9kb,并确定了其候选基因。该研究通过构建水稻TWH基因的RNAi表达载体，利用根癌农杆菌EHA105介导法将其导入水稻品种武育粳3号中，获得了转基因水稻植株，为TWH基因的功能研究奠定了基础。1材料与方法1.1试剂1.2载体及菌株1.3植物材料和遗传转化方法供试水稻材料为武育粳3号成熟种子诱导初生愈伤组织，作为与农杆菌共培养转化的受体材料。水稻的

4、组织培养、农杆菌介导转化水稻以及抗性愈伤组织的筛选与植株再生等参照刘巧泉等［6］建立的高效转化方法进行。1.4PCR引物设计及目的片段扩增1.5目的片段的克隆将目的片段切下，通过胶回收试剂盒回收PCR产物并纯化后连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布在含100mg/L氨节青霉素的X-Ga1/IPTG的LE固体培养基上，37°C培养过夜，挑取白色单菌落于含100mg/L氨节青霉素的LB液体培养基中培养过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pMD18-T-TWH，将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。1・6RN

5、Ai表达载体的构建7转基因植株的PCR检测2结果与分析2・1RNAi表达载体构建2.2水稻遗传转化及转基因植株的获得以武育粳3号成熟胚诱导的愈伤组织作为转化受体，经根癌农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将表达载体pR1301-TWH导入水稻中。经潮霉素抗性筛选，选择生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化再生培养，最终获得40株TO代转基因植株。以转基因植株叶片总DNA为模板,用潮霉素基因特异引物P7与P8进行PCR检测（图5）,共有34株检测到517bp左右的目标片段，PCR阳性率为85%。3小结与讨论1）虽然RNA干涉在作用机制等方面还不十分清楚，但

6、作为一种新的技术方法，已经在各个不同的生物研究中被广泛应用。应用RNA干涉技术迅速地抑制目的基因的表达，能尽快了解到目的基因的功能。该研究将构建的表达载体pR1301-TWH导入水稻愈伤组织中，获得了阳性转基因植株，下一步计划将转基因苗移栽到海南试验基地，抽穗后进行表型鉴定和表达分析，研究TWH基因的功能。2）载体设计是载体构建的关键。由于RNAi机制只对成熟的mRNA产生作用，因此用于设计RNA干涉载体的靶序列应处于基因的一个外显子内。Wesley等[7]的研究表明RNAi片段的长度在98〜853nt之间都是可行的，不会对沉默效率产生明显影响；

7、同时将间隔区内含子插入反向互补重复区可以增强其稳定性。因此，在本研究中我们选择TWH基因一个外显子部分的253bp为靶序列构建RNAi载体，并在两个反向重复序列间加入一个Waxy基因的内含子作为间隔区，目的是为了提高转基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表达。参考文献：[1]FIREA,XUQ,MONTGOMERYnetNature,[2：]CHENJ,TANGWH,HONGMM,eta1・OsBP—73,aricegene,encodesanove169)：806-811.DNA—binding■1htproteinwomainandgenr

8、ferenceedRNAigrowth[J].antrBiology,(3)：[3]PRASADK,JAYRAGHAVANU・Doub1