dsrna介导的抗tomv和cmv植物表达载体的构建及遗传转化

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1、分类号：密级：请注明密级及保密期限学号：2009107058单位代码：10759石河子大学硕士学位论文dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建及遗传转化学位申请人张伟指导教师黄家风教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称植物病理学研究方向植物病毒及其病害防治所在学院农学院中国·新疆·石河子2012年6月ConstructionofVectorExpressingVirus-deriveddsRNAandGeneticTransformationofRepeatChimericGene

2、fromCMVandToMVADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofAgricultureByZhangWei(PlantPathology)DissertationSupervisor:Prof.HuangJia-fengJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取

3、得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定

4、。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日中文摘要黄瓜花叶病毒和番茄花叶病毒是茄科植物上的两种主要病毒。常以复合侵染的方式危害植物，使受害植株轻则表现花叶、矮化，重则表现蕨叶、畸形和坏死，是制约新疆、甘肃和内蒙加工番茄生产的重要因素。利用RNA沉默原理即将病毒本身的某些基因以反向重复方式转化到植物基因组中获得抗性植株是当前病毒病防治的主要途径。本研究以严重危害新疆加工番茄的两种病毒CMV与ToMV为目标，从田间采集表现坏死条斑的加工番茄病株，设计2对针对CMV2b基因和ToMVMP基因的特异

5、引物，对病株进行相应目标基因的RT-PCR、克隆和测序，结果获得336bp和795bp核苷酸序列。基因库检索表明，它们分别为CMV2b基因和ToMVMP基因。序列比对发现：CMV2b序列与其他已登录的核苷酸序列同源性为97.0%~97.5%，氨基酸同源性为96.0%~96.4%。ToMVMP基因与已登录的核苷酸序列同源性为99.0%~99.5%，氨基酸同源性为97.5%~98.4%；根据已测ToMVMP基因和CMV2b基因的序列设计特异性引物和中间引物，通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合，获

6、得长度为676bp的融合基因△MP-2b。再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连，并定向插入到植物表达载体pBin438上35S启动子下游，构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBin438△MP-2b（i/r）。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。利用三亲交配法将带有△MP-2b基因反向重复的植物表达载pBin438-△MP-2b(i/r)转入到根癌农杆菌EHA105中，通过PCR和酶切鉴定阳性的转化子用于烟草和加工番茄的转化。将含有融合基因△MP-2b的农杆菌分别

7、与烟草叶盘和加工番茄子叶叶盘共培养。经卡那霉素与羧苄青霉素抗性筛选分别获得转融合基因△MP-2b的再生烟草植株24株和加工番茄植株12株，所有植株的PCR检测均为阳性。本研究结果为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。关键词：黄瓜花叶病毒；番茄花叶病毒；融合基因；反向重复；遗传转化IIIAbstractCucumbermosaicvirus(CMV)andTomatomosaicvirus(ToMV)aretwomainvirusinsolanaceaeplants.Mixedinfe

8、ctionofCMVandToMVcauseplantsshowingmosaic,stuntsymptoms,sometimesevenshowingfern,deformityandnecrosissymtoms,whichisamajorthreattoprocessingtomatoproduction.RNAsilencingisapost-transcriptionalgenesilencingphenomenoninducedbydoublestrandedRNA(d