dsrna介导的转基因加工番茄抗cmv研究

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1、分类号：密级：学号：2009107061单位代码：10759石河子大学硕士学位论文dsRNA介导的转基因加工番茄抗CMV研究学位申请人刘炜炜指导教师黄家风教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称植物病理学研究方向植物病毒及病毒病害所在学院农学院中国·新疆·石河子2012年6月DsRNA-mediatedResistancetoCucumbermosaicvirus(CMV)inTransgenicProcessingTomatoPlantsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityIn

2、PartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLiuWeiwei(PlantVirology)DissertationSupervisor:AssociateProfessorHuangJiafengJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本

3、文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）是一种寄主范围非常广

4、范的植物病毒，是造成新疆加工番茄坏死条斑病的重要因素，严重影响加工番茄的品质和产量。利用基因工程原理将病毒本身的一些基因转化到植物基因组中获得抗性植株是当前病毒病防治的主要途径。本文的主要研究内容与结果如下：1.根据已报道CMV复制酶基因和2b基因设计特异性引物，从石河子实验站采集表现严重花叶症状的加工番茄，利用RT-PCR分别扩增两个片段，克隆并测序。其中CMV复制酶基因为1627位核苷酸开始的546个核酸片段，同源性比较表明，它与已报道的AJ319666的同源性最高，为98.3%；扩增得到的2b基因全长336个核苷酸，编码

5、111个氨基酸。序列比对表明，扩增得到的CMV2b基因与已报道2b基因DQ873567的核苷酸序列同源性最高，达97.0%，与其氨基酸相似性达到97.0%。2.根据已测CMVRep基因和CMV2b基因的序列设计特异引物，通过PCR扩增到CMV379bp△Rep基因片段和336bp2b基因片段。然后将2个目的基因片段分别以反向重复的方式与大豆内含子相连，得到含有目的基因片段反向重复序列的重组质粒pBlueSK-Intron△Rep(i/r)和pBlueSK-Intron2b(i/r)。再用限制性内切酶切下包含Intron在内的反

6、向重复的目的基因片段，并定向插入到植物表达载体pBIN438上，分别构建成功含CMV基因的植物表达载体pBIN438△Rep(i/r)和pBIN4382b(i/r)。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。3.通过对里格儿87-5和亚心98-1两个加工番茄栽培品种的离体再生体系的研究，结果表明，激素的种类和浓度对加工番茄外植体出愈率的影响没有差异，但是诱导形成的愈伤组织形态和不定芽存在差异，ZT与IAA组合对不定芽的诱导效果高于6-BA与IAA组合，不定芽诱导率最高的培养基组合为MS+ZT0.5mg/L+IAA0

7、.2mg/L。并且品种之间存在差异，亚心98-1比里格尔87-5更易产生较高比率的正常芽。再生芽在1/2MS+0.1mg/LIAA生根培养基上能正常生根。建立了加工番茄亚心98-1优化的离体再生体系。4.通过三亲交配法，将植物表达载体pBIN438△Rep(i/r)转入农杆菌EHA105，叶盘法转化烟草叶盘和加工番茄子叶叶盘，最终成功获得33株转基因烟草和6株转基因番茄植株。对两种抗性植株进行PCR检测，扩增出了目标片段，初步表明△Rep基因反向重复片段已经整合到烟草和加工番茄基因组中。5.用同样的方法，将植物表达载体pBIN

8、4382b(i/r)转入农杆菌EHA105，经过叶盘法进行遗传转化，最终成功获得11株转基因烟草和5株转基因番茄植株。对两种抗性植株进行PCR检测，扩增出了目标片段，初步表明2b基因反向重复片段已经整合到烟草和加工番茄基因组中。关键词：黄瓜花叶病毒，反向重复，转基因植株，RN