bdnf基因转染骨髓基质细胞内耳移植在豚鼠耳蜗表达的初步的研究

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1、摘要第一章人脑源性神经营养因子基因克隆及其表达载体构建目的脑源性神经因子(brain．derivedneurotrophicfactor，BDNF)作为神经生长因子家族成员，与外周听觉系统有着密切关系，不仅对耳蜗前庭神经元的发育、增殖分化、存活起重要作用，而且对损伤后神经元的修复、存活与功能重塑也起了重要作用。近年来神经生长因子家族一些成员纷纷被克隆并应用于内耳疾病的防治，已取得可喜进展。在此基础上，本研究对人脑源性神经营养因子(hBDNF)进行克隆，并构建hBDNF真核表达载体pcDNA3．1(．)．BDNF，为耳聋防治进一步研究提供了基因来源。方法RT-PCR扩增人胚胎脑组

2、织hBDNF基因片段，连接到pGEM．T质粒载体上，转化大肠杆菌JMl09，经Amp抗性、质粒DNA抽提、酶切鉴定筛选得到阳性克隆，进行测序。将测序正确的质粒pGEM-T-BDNF与pcDNA3．1卜)在BamHI和Hind]]／限制性核酸内切酶作用下的产物，在T4DNA连接酶作用下连接生成质粒pcDNA3．1(．)．BDNF，转化大肠杆菌JMl09，经Amp抗性筛选、质粒DNA抽提、酶切鉴定得到阳性克隆。结果应用PCR技术和T载体克隆法克隆hBDNF基因，筛选阳性克隆、酶切鉴定、DNA序列测定证实克隆插入片段含hBDNF基因全长编码序列。从pGEM-T-BDNF中获取hBDN

3、F片段，与pcDNA3．1(．)连接，构建重组质粒pcDNA3．1(．)．BDNF，结果证实插入片段为hBDNF基因全长片段。结论成功构建了含BDNF基因的真核表达载体：pcDNA3．1(．)一BDNF，为开展内耳转基因研究提供了重要的基因来源。关键词脑源性神经营养因子，基因克隆，质粒第二章Lipofectamine，。M2000介导BDNF基因转染耳蜗实验研究目的在耳蜗基因治疗中，安全可靠的基因导入途径是实现耳蜗内基因治疗的关键，获得稳定、高效目的基因表达是我们治疗目的。为此我们以重组质粒pcDNA3．1f．)．BDNF作为外源性基因，与脂质体LipofectamineTM2

4、000一起转染耳蜗。观察该过程对听觉功能的影响与耳蜗组织形态的变化，并确定转导细胞的表达分布，为今后的内耳基因治疗的深入研究打下基础。方法采用显微注射技术经豚鼠耳蜗底周鼓阶钻孔向实验动物外淋巴腔中导入脂质体与质粒基因复合物，对照组耳蜗内注射人工外淋巴液。动物分别在术后7天、14天、28天不同时间点麻醉处死，并在术前与处死前一天行耳蜗复合动作电位(CAP)阈值测定。耳蜗标本经固定、脱钙、石腊包埋后行HE染色观察耳蜗组织病理学变化；BDNF免疫组化方法检测基因转染耳蜗表达。结果基因转染耳蜗后，CAP阈值没有明显变化。组织学观察耳蜗各回结构完整，Corti器、血管纹、螺旋韧带及螺旋神

5、经节形态结构正常。基因转染后第7天和第14天在双侧耳蜗广泛区域内检测到BDNF表达；第28天的耳蜗标本也可检测到较弱的阳性反应。结论LipofectaminerM2000介导pcDNA3．1(．)．BDNF转染耳蜗，对耳蜗组织形态与听觉功能影响不大；而且能够使BDNF在耳蜗广泛区域高效表达。关键词LipofectaminerM2000，转染，耳蜗复合动作电位，表达第三章骨髓基质细胞及其联合质粒．脂质体复合物耳蜗内移植的初步研究目的将标记的骨髓基质细胞移植于耳蜗内，初步观察它在耳lI蜗内的存活情i：；己：在此基础上，将细胞联冈脂质体与质粒pcDNA3。l(一≥，BDNF静藿予耳娲

6、，耪步躐察俸内舔辘TBDNF蒸毽转染修饰骨髓基质细胞的情况，从而为今厝的体细胞绒转基因治疗内耳疾病研究打下良好的基础。方法将豚鼠骨髓基质细麓分离臻养，焉DAPI翔戬标记，采用耳蜗基因导入途径，经耳蜗底周鼓阶钻孔移植细胞以及质粒和脂质钵复台物。10天螽动物麻醉势处死，写蜗标本行石艟包埋切片，彳亍荧光检测移植细胞存活情况，神经丝蛋白免疫组化染色观察移植细胞分化与转归，BDNF免疫组化实验观察hBDNF对移植细胞的转染。缮果l§天露骨髓基矮缨麓在鲜瞒体悫仍然存活，大部分存在于鼓阶中，有的已贴壁，衡的具有贴壁生长趋势。复合移植缎中移植细胞有BDNF弱阳性表达，而单纯细胞移植组无BDNF

7、及神经丝蛋自表达。结论本研究进行了耳蜗内细胞移植的探索性研究，发现骨髓基质细胞移植耳蜗后能够存滋，具有贴壁生长趋势；耳蜗体内环境下，瑟质体介导BDNF基因藐够转染移植的缀施，使其努泌BDNF，为进一步威用体细胞移植治疗感脊神经性聋研究开拓了思维，奠定了理论和实验基础。关键词骨髓基质细胞，细胞移植，神经丝蛋囱，基因工程细胞IllABSTRACTPartIMolecularcloningofhumanBDNFgeneandconstructionofrecombinantpcDNA3．1(-)-