bdnf基因转染骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及对耳蜗螺旋神经元保护作用初步研究

《bdnf基因转染骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及对耳蜗螺旋神经元保护作用初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中南大学博士学位论文BDNF基因转染骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及对耳蜗螺旋神经元保护作用初步研究姓名：刘谦虚申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：谢鼎华20090501博士学位论文中文摘要第一章人脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及表达目的神经营养因子(neurotrophicfactors，NTFs)在神经系统的生长发育、功能维持过程中发挥重大影响。近年来神经营养因子家族一些成员纷纷被克隆并应用于神经系统疾病的防治，取得了可喜进展。脑源性神经营养因子(brain—derivedneur

2、otrophicfactor，BDNF)作为神经营养因子家族成员，与外周听觉系统有着密切关系，不仅对耳蜗前庭神经元的发育成熟、增殖分化起重要作用，而且对损伤后神经元的修复、存活与功能重塑也影响深远。在此基础上，本研究对人脑源性神经营养因子(humanBDNF，hBDNF)进行克隆，构建hBDNF真核表达载体pcDNA3．1(．)一BDNF，并用该载体转染人胚胎肾293细胞(humanembryokidney293cells，HEK293)后检测BDNF的表达，为耳聋防治的进一步研究提供了基因来源。方法RT．P

3、CR扩增人胚胎脑组织hBDNF基因片段，将基因片段与pcDNA3．1(．)质粒连接制成重组质粒。转化、筛选及扩增重组质粒，用EcoRI和BamHI酶切分析鉴定BDNF是否插入重组质粒。小量提取重组质粒后进行测序分析，将酶切检测和测序正确的pcDNA3．1(．)．BDNF重组质粒用QIAGEN．TIPl00大量提取。重组质粒转染HEK293细胞，WesternBlot法检测细胞中BDNF的表达。结果应用RT．PCR技术克隆出hBDNF基因。将hBDNF片段与pcDNA3．1(．)连接，成功构建重组质粒pcDNA

4、3．1(一)一BDNF。酶切博士学位论文中文摘要鉴定、DNA序列测定结果证实插入片段为hBDNF基因全长片段。WesternBlot法检测到转染pcDNA3．1(．)一BDNF的HEK293细胞中有BDNF的表达。结论成功构建了含hBDNF基因的真核表达载体：pcDNA3．1(一)．hBDNF，为开展基因治疗提供了重要的基因来源。关键词脑源性神经营养因子基因，质粒，构建，表达第二章脑源性神经营养因子基因电穿孑L法转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞观察目的探讨骨髓间充质干细胞(bone—malTOW

5、mesenchymalstemcells，BMSCs)在转染人脑源性神经营养因子(BDNF)基因后在体外分化为神经元样细胞的功能。方法人BDNF基因克隆并构建其真核表达载体。取5只豚鼠的骨髓，分离培养贴壁细胞，观察其形态。CD34、CD44、CD45抗体流式细胞术鉴定所培养的细胞为BMSCs。将人BDNF基因电穿孔法转染BMSCs，G418筛选后用维甲酸(RA)诱导分化，神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋1刍(GFAP)抗体免疫细胞化学对分化细胞进行鉴定。结果分离培养的细胞

6、具有典型的BMSCs形态和标志，人BDNF基因电穿孔法转染BMSCs的转染率约为25％，转染诱导后的细胞在外观上类似神经细胞，表达NSE、Nestin和GFAP。Ⅱ博士学位论文中文摘要结论BDNF基因转染的BMSCs在体外能分化为神经元样细胞，电穿孔法能提高转染率，RA有促诱导作用。关键词脑源性神经营养因子基因，电穿孔，骨髓间充质干细胞，神经元样细胞第三章脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞耳蜗内移植初步观察目的探讨脑源性神经营养因子基因转染的骨髓间充质干细胞在受损耳蜗内的分化及保护功能。方法将转染了脑

7、源性神经营养因子基因，并在体外诱导分化的骨髓间充质干细胞(BDNF．BMSCs)标记后，通过鼓阶注射植入阿米卡星致聋的豚鼠耳蜗内。并设耳蜗单纯注射人工外淋巴液、BMSCs、BDNF基因作为对照组。分别在注射后lW、2W、4W取耳蜗组织石蜡包埋切片。HE染色观察耳蜗组织病理学变化，计算SGNs密度；了解BMSCs的分布；NSE、Nestin和GFAP抗体免疫组织化学，观察BMSCs在蜗内的分化和SGNs的存活情况。结果阿米卡星致聋后豚鼠耳蜗结构受到损伤，SGNs数减少。诱导分化前后的BMSCs在耳蜗内均能成活并

8、分布到一定的区域。NSE、Nestin和GFAP免疫化学可见诱导分化后的BMSCs部分细胞阳性染色，而未诱导分化的BMSCs阳性细胞较少。用平均光密度(averageopticaldensity，AOD)分析免疫化学结果显示：耳蜗内BDNF—BMSCs在lW、2W时保持了较高的AOD值，和体外比较无明显区别，TTT博十学位论文中文摘要但在4W时显著下降(P