兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会

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1、兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会摘要：骨关节炎(osteoarthritis,0A)是一种以关节软骨进行性退变病变慢性疾病，近些年发病率在不断增高。基础研究主要有各种原因引起的细胞数量过少而无法开展下去。在建立动物模型的基础上更有效的提取软骨细胞、体外培养对基础研究做出最基本铺垫，为临床治疗提供更有效的理论依据。本文通过软骨的提取、软骨的消化、细胞的收集、培养、鉴定，结合国内外文献做一综述。关键词：骨关节炎；软骨细胞；体外培养软骨组织(cartilage)由软骨细胞(chondrocyte)和细胞外基质(

2、extracellularmatrix,ECM)构成，软骨细胞是关节软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治疗骨关节炎、最基本最关键的一步［1］。自从1967年Manning［2］采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。但不同的动物，不同的模型对软骨细胞的

3、提取也有一定的不同。本文通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点及关键问题等。1软骨的提取将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6cmX6cm的区域，浸泡于75%的酒精中20〜30min,放入超净台中打开膝关节腔,无菌条件下用11号刀片(带柄)削取膝关节股骨課和胫骨平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液(1X1010U/L)的D-hanks液的无菌平皿中,用含双抗液(1X10

4、9U/L)的D-hanks液10mL漂洗3遍,用眼科剪将软骨组织剪成lmm3小块，见图1,然后再用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液10mL漂洗3遍。在软骨的提取过程中首先必须在无菌的条件下打开关节削取软骨，我们总会最大量的削取更多的软骨使得提取更多软骨细胞，但更要主要的是①避免削取软骨以外的组织，避免细胞提取还有其他组织细胞；②削取软骨时不要削的太厚，可以一层层的削，这样可以有助于软骨的消化；③削取完后软骨组织必须剪成1m3小块，有助于软骨的消化，用缓冲液多清洗几遍更好地去除血液、脂肪组织等

5、其他组织。2软骨的消化用0.25%胰蛋白酶先消化30〜35min,用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液10mL漂洗3遍；加入0.2%II型胶原酶(DMEM配制)，置于37°C,体积分数5%C02培养箱中培养消化100min,每30min置37°C恒温振荡箱振荡5min。后抽取上清液用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800r/min离心4min弃上清，用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液洗两遍每次800r/min离心4rniri弃上清去除胶原酶。加入含12%胎牛血清DMEM3mLo用

6、枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。将软骨细胞按1X105/L浓度接种于10mL培养皿中，置于37°C,体积分数5%C02培养箱中培养。培养皿中剩余的软骨加入1%II型胶原酶(DMEM配制)置于37°C,体积分数5%C02培养箱中培养消化，每lh置379恒温振荡箱振荡5min。倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800r/min离心4min弃上清，用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液洗2遍800r/min/次，离心4min弃上清去除胶原酶。加入含12%胎牛血

7、清DMEM3mLo用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。将软骨细胞按1X105/L浓度接种于10mL培养皿中，置于37工，体积分数5%C02培养箱中培养。待细胞贴壁达到85%〜90%后传代。很多文献中软骨细胞消化都在3〜6h,然而软骨细胞的消化时间要大大缩短，这也是兔膝骨关节炎模型的一个弊端，因为兔子的软骨细胞消化时间过长越长细胞损伤越厉害，虽然有时我们在细胞计数时看到的都是活细胞，但放到培养瓶里样上两天基本上没有贴壁的，软骨细胞也是一种群居生活的物种，贴壁细胞越少增值能力越低。3细胞的传代及培养软骨细胞培

8、养方法很多，包括单层培养法、三维培养法、离心管培养法、生物反应器等。其中单层培养法、三维培养法用的比较多，因三维培养法需要付出昂贵的费用本实验采用单层培养法来培养兔膝骨关节炎软骨细胞。软骨细胞呈贴壁生长后，随传代次数增加，软骨细胞发生去分化现象，限制了软骨细胞的大量扩增。其中应该注意的是提取软骨细胞时应用含12%〜13%FBS培养基进行培养，从第二代细胞开始改用含10%FBS培养基进行培养，每3d换液1次，细胞融合并覆盖瓶底＞