降钙素在体内和体外实验中对兔关节炎关节软骨的保护作用

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1、降钙素在体内和体外实验中对兔关节炎关节软骨的保护作用【摘要】［目的］研究降钙素（calcitonin，CT）对骨性关节炎关节软骨的保护作用。［方法］32只6个月龄新西兰大白兔，雌雄各半，行右膝关节前交叉韧带切断术。术后1周将动物随机分为实验组和对照组。实验组皮下注射鲑鱼降钙素5IU／（kg·d），连续6周；对照组则给予等剂量盐水。术后7周处死动物。取股骨内髁制成切片行HE、番红-固绿和MMP-3免疫组化染色。取膝关节软骨行胶原酶消化法提取软骨细胞进行体外培养，于第Ⅱ代融合90％后提取mRNA，采用

2、实时荧光定量PCR方法检测MMP-3，aggrecan的表达。HE切片Mankin评分。番红-固绿和MMP-3免疫组化染色切片用图像分析仪测量平均灰度值。PCR结果记录Ct值。［结果］实验组关节软骨的组织学Mankin评分结果，番红-固绿和MMP-3免疫组化染色平均灰度值测量结果低于对照组（P＜0.05）；实验组体外培养软骨细胞的MMP-3的RNA含量低于对照组（P＜0.05），aggrecan的RNA含量高于对照组（P＜0.05）。［结论］降钙素5IU／（kg·d）皮下注射能够增加体外培养软骨细

3、胞分泌的aggrecan的含量以及下调MMP-3的表达；可能通过体内明显减轻兔膝关节软骨基质的降解，减少MMP-3的表达而保护软骨。【关键词】降钙素；骨性关节炎；基质金属蛋白酶3；软骨细胞Abstract:［Objeetive］Toaccessentanteriorcruciateligamenttransaction（ACLT）ontherightkneeandlyintotoncalcitoninatadoesof5IUperkgofbodyedoes.Allrabbitsmunostaine

4、dMMP-3antibodies.ChondrocytesexpressionsofMMP-3andaggrecaninedbyRealtimeRT-PCR.［Result］Thescore,thegreyvalueofSafranin-O-fastgreenofACLT+CTgrouponealcitoninatadoesof5IU/kgofbodyatrixandreducingtheexpressionlevelsofMMP-3invivo.Keyatrixmetalloproteinase

5、-3;chondrocyte骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是老年人常见的疾病之一。其特点是进行性关节软骨丧失，新骨形成，软骨下骨小梁与生长板硬化，骨赘形成，基质降解使软骨丢失和基质修复之间失去平衡。长期以来对OA关节软骨的改变进行了较多研究，基质金属蛋白酶（matixmetalloproteases，MMPs）因参与体内细胞外基质的降解，在OA关节软骨基质及软骨细胞破坏的病理过程起着重要作用而被广泛重视〔1〕。目前关于降钙素对软骨作用的研究多为单纯体内实验或者单纯体外实验。本研究

6、在作者以往研究的基础上，采用兔不稳定膝关节诱导骨关节炎模型，用体内实验结合体外实验的方法，以软骨基质及破坏基质的酶-MMP-3为研究对象，进一步研究降钙素对关节软骨的保护作用并探讨其具体作用机理，进而为临床应用提供依据。1材料与方法1.1动物分组与手术健康6个月龄新西兰大白兔32只，雌雄各半（购自北京维通利华公司，批号：SCXK京，2002-2007）。随机分为两组，行右膝关节前交叉韧带切断术（anteriorcruciateligamenttransaction，ACLT）。1.2给药方法ACL

7、T+CT（calcitonin）组每日1次皮下注射降钙素（瑞士诺华制药北京公司）5IU／kg，ACLT组给予等剂量生理盐水皮下注射；ACLT组左膝关节作为空白对照组与右膝关节对照以确定造模成功，ACLT组和ACLT+CT组右膝关节对比确定降钙素对关节软骨的作用。1.3标本采集和处理动物处死后，立即解剖膝关节。ACLT+CT组和ACLT组分别8只动物，切下股骨髁置于4％多聚甲醛中固定，15％EDTA-2Na溶液脱钙，石蜡包埋，沿正中矢状面作4μm连续切片。行HE染色，番红-固绿（safranin“O

8、”andfast-green）染色，MMP-3免疫组化染色。另外ACLT+CT组和ACLT组各8只动物在无菌环境下用手术刀片切取膝关节面软骨，严格去除其他组织。于超净台内剪成1mm×1mm×1mm的碎片后用0.2％Ⅱ型胶原酶37℃水浴震荡7h，2000r/min离心10min后弃去上层液体，加单纯培养基吹打后用2000目筛网过滤，2000r/min离心；弃上层液体，加入10ml完全培养基吹打后计数，以105密度接种于35mm2培养瓶，放于37℃CO2培养箱培养。于第Ⅱ代融合90％后