人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定

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1、人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定作者：陈武，莫炜，张艳玲，宋钢，宋后燕【摘要】　　目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体(PLGΔK)的毕赤酵母(Pichiapastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7.5L发酵罐对工程菌PLGΔK/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLGΔK等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S2403分别测定PLGΔK激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果7.5L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量

2、，经三步纯化后制备的PLGΔK纯度大于96%。理化分析显示PLGΔK的等电点为7.5～7.8，分子量：27.787kD，比活性：23.6U/mg。结论初步建立了PLGΔK的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。【关键词】毕赤酵母kringle区纤溶酶原缺失突变体纯化Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpression,purificationandcharactersofthekringledomaindeletionmutantofhumanplasminogen(PLGΔK)inPichiapa

3、storis.MethodsFermentationathighdensity(A600>200)ina7.5Lfermentertheculturebrothinathreestepprocess:ultrafiltration,gelfiltration,ionexchangechromatography,andolecularidolyticactivityeasuredogenicpeptidesubstrateS2403respectively.ResultsFermentationin7.5Lscaleyieldedanexpressionlevelofapprox

4、imately400mgPLGΔKperliterfermentationbroth.Throughthreestepsofpurification,thePLGΔKhadapurityofover96%.TheexactMSanditsIPediateproductionareparabletothatofplasminogenextractedfromhumanplasma,indicatingagoodperspectiveinscaleupandapplication.　　Keyutant;kringledomain;Pichiapastoris;plasminogen;puri

5、fication　　人纤溶酶原(plasminogen,PLG)是人体纤溶系统的主要成分，在体内经纤溶酶原激活剂(plasminogenactivator,PA)激活后，转变为纤溶酶(plasmin,PLM)，不仅发挥溶栓作用，还参与体内一系列与蛋白水解有关的生理病理过程，如炎症、组织修复、排卵、肿瘤侵袭和转移等。长期以来，纤溶酶被认为是一种具有潜力的直接溶栓药物，但由于分子量大、结构复杂、富含糖链且易自身降解，采用大肠杆菌、哺乳动物细胞表达效率较低[1,2]，因此对PLG进行结构改造是近年来研究的热点。本室宋钢等采用毕赤酵母表达了一种纤溶酶原kringle区缺失突变体(PLGΔK)，经

6、激活后，具有较好的纤溶活性[3]。本实验在此基础上，深入研究了高密度发酵和纯化工艺，使其更适合大规模制备，并对其理化性质进行研究，为纤溶酶的开发利用提供了实验基础。　　1实验材料　　毕赤酵母表达菌PLGΔK/GS115由实验室自行构建;纤溶酶、纤溶酶原、三肽化合物S2403(L焦谷氨酰L苯丙氨酰L赖氨酸对硝基苯胺)购自Sigma公司;YNB、酵母提取物购自Difco公司;其余试剂均为国产分析纯;SephacrylS100HR、Superdex75、SPSepharoseFF(美国AmershamPharmacia公司);3kD、50kD超滤膜(MilliporePell

7、icon);ProfluxM12超滤仪(Millipore);BIOFLO3000型7.5L发酵罐及C25kC型温控摇床(美国NBS公司)。　　2方法　　2.1PLGΔK表达菌7.5L罐批发酵　　采用NBS7.5L发酵罐高密度发酵，发酵条件控制：温度29.5℃(PID模式)，pH5.1(PID模式)，溶氧(35.0±5.0)%(Agit模式)，搅拌300～700r/min(D.O.模式)。　　甘油补加：初始速率为0.6mL·