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1、香烟烟雾提取物对气道上皮细胞增殖和FIP200表【关键词】气道上皮细胞Effectofcigarettesmokeextractonproliferationandcycleofhumanairokeextract（CSE）ontheproliferationandcycleofhumanairechanism.METHODS:Afteraireasuredetry.FAKfamilyinteractingproteinofMr200000(FIP200)mRNAexpressionlevel,FAKfamilyinteractingpro
2、teinofMr200000（FIP200）expressionlevelandtheassociationofFIP200erasechainreaction（RTPCR）,TT吸光度比对照组明显降低，G1期细胞增多，S和G2期细胞明显减少（P<0.01），FIP200mRNA,FIP200的表达水平以及FIP200与FAK的连接均显著增高（P<0.01），且随CSE干预时间和CSE浓度而增大；气道上皮细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK连接的增高均与G1期细胞增多呈正相关（P<0.01），与S和G2期细胞减少
3、呈负相关（P<0.01）.结论：CSE显著抑制气道上皮细胞的增殖，FIP200的高表达可能是其作用机制之一. 【关键词】香烟烟雾提取物；气道上皮细胞；细胞增殖；FIP200 0引言 气道上皮是呼吸器官对抗有害刺激的第一道防线，上皮受损后的及时修复是维持气道稳态的重要环节.支气管上皮细胞损伤脱落是哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等呼吸道疾病的起始环节和病理基础，而气道疾病的缓解有赖于上皮完整性的修复与维持.其修复包括细胞向损伤部位迁移，细胞增殖和细胞细胞、细胞细胞外基质黏附等中心环节［1，2］.吸烟是呼吸道疾病的重要原因之一，它可
4、能通过多种机制引起呼吸道疾病的发生发展.已有很多实验证实由吸烟引起的炎症对气道疾病的重要性，但吸烟是否通过影响气道上皮细胞增殖从而影响其损伤修复尚未有报道，我们将以此为目的进行实验研究. 1材料和方法 1.1材料 按Akamura等［3］方法，将2支去过滤嘴香烟（红双喜牌，武汉卷烟厂生产）于一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50mL无血清培养液中制成悬液.悬液用1mol/LNaOH调至pH7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤备用.制备的香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,
5、CSE)在30min之内用于实验.人支气管上皮细胞系MBE由中国医学科学院肿瘤研究所程书钧院士惠赠,用DMEM:F12无血清培养基培养，加入人重组表皮生长因子5μg/L,胰岛素5g/L,转铁蛋白10g/L,氢化可的松0.2mol/L,三碘甲状腺素0.65g/L,肾上腺素0.5g/L,牛垂体粗提物35g/L,乙醇胺0.5mol/L（均购自Gibco公司）,庆大霉素100g/L,青霉素100g/L,链霉素100g/L，最后用NaHCO3滴定到pH7.0.细胞接种于覆盖有40mg/LFN的培养板，37℃含50mL/LCO2温箱培养，待细胞80%融
6、合成片时，换用含CSE的培养液继续培养. 1.2方法 96孔培养板接种细胞，培养干预后，每孔先后加5g/LMTT液20μL和DMSO150μL，用酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度；其中每个浓度或时间点重复3次实验，每次重复6个复孔.制备单细胞悬液，预冷的无水乙醇固定，PBS漂洗，用4℃碘化丙啶染色30min，取1×106个细胞在流式细胞仪上进行细胞周期分析.采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法从细胞中提取总RNA为模板，按MBI公司RTPCR试剂盒说明书合成cDNA为模板，加入Taq酶和dNTP等进行PCR.FIP200引物由上海博
7、亚公司合成：上游引物：5′TCAGGTGGGAGATTTG3′，下游引物：5′TCCATGATACGGCTTT3′，扩增片断大小269bp；βactin上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGTATTC3′，扩增片断大小540bp.另用预冷的RIPA细胞裂解缓冲液0.25mL裂解细胞，用改良的LoL/LCSE干预6，12，24和36hA值均降低（P<0.01）；呈时间和浓度依赖性（P<0.01,Fig1）. 流式细胞分析（Tab1,2）中G2期数据方差不齐
8、，均先采用反正弦平方根变换为方差齐性后再做单因素方差分析，发现100mL/LCSE干预6，12，24和36hG1期细胞数比对照组增高（P<0.01），S期及G2期细胞数量明
