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1、香烟烟雾提取物对气道上皮细胞增殖和FIP200表达的影响论文【关键词】气道上皮细胞Effectofcigarettesmokeextractonproliferationandcycleofhumanairokeextract（CSE）ontheproliferationandcycleofhumanairechanism.METHODS:Afteraireasuredetry.FAKfamilyinteractingproteinofMr200000(FIP200)mRNAexpressionlevel,FAKfamilyinteractingprot
2、einofMr200000（FIP200）expressionlevelandtheassociationofFIP200erasechainreaction（RTPCR）,TT吸光度比对照组明显降低，G1期细胞增多，S和G2期细胞明显减少（P0.01），FIP200mRNA,FIP200的表达水平以及FIP200与FAK的连接均显著增高（P0.01），且随CSE干预时间和CSE浓度而增大；气道上皮细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK连接的增高均与G1期细胞增多呈正相关（P0.01）.freelura等［3］方法，将2支去过滤嘴香烟（红双喜牌，
3、武汉卷烟厂生产）于一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50mL无血清培养液中制成悬液.悬液用1mol/LNaOH调至pH7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤备用.制备的香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)在30min之内用于实验.人支气管上皮细胞系MBE由中国医学科学院肿瘤研究所程书钧院士惠赠,用DMEM:F12无血清培养基培养，加入人重组表皮生长因子5μg/L,胰岛素5g/L,转铁蛋白10g/L,氢化可的松0.2mol/L,三碘甲状腺素0.65g/L,肾上腺素0.5g/L,牛垂体粗提
4、物35g/L,.freelol/L（均购自Gibco公司）,庆大霉素100g/L,青霉素100g/L,链霉素100g/L，最后用NaHCO3滴定到pH7.0.细胞接种于覆盖有40mg/LFN的培养板，37℃含50mL/LCO2温箱培养，待细胞80%融合成片时，换用含CSE的培养液继续培养.1.2方法96孔培养板接种细胞，培养干预后，每孔先后加5g/LMTT液20μL和DMSO150μL，用酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度；其中每个浓度或时间点重复3次实验，每次重复6个复孔.制备单细胞悬液，预冷的无水乙醇固定，PBS漂洗，用4℃碘化丙啶染色3
5、0min，取1×106个细胞在流式细胞仪上进行细胞周期分析.采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法从细胞中提取总RNA为模板，按MBI公司RTPCR试剂盒说明书合成cDNA为模板，加入Taq酶和dNTP等进行PCR.FIP200引物由上海博亚公司合成：上游引物：5′TCAGGTGGGAGATTTG3′，下游引物：5′TCCATGATACGGCTTT3′，扩增片断大小269bp；βactin上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGTATTC3′，扩增片断大小540bp.另用预冷的RIPA细胞裂解缓
6、冲液0.25mL裂解细胞，用改良的LoL/LCSE干预6，12，24和36hA值均降低（P0.01）；呈时间和浓度依赖性（P0.01,Fig1）.流式细胞分析（Tab1,2）中G2期数据方差不齐，均先采用反正弦平方根变换为方差齐性后再做单因素方差分析，发现100mL/LCSE干预6，12，24和36hG1期细胞数比对照组增高（P0.01），S期及G2期细胞数量明显减少(P0.01)，而且这些变化均随CSE浓度的增加而有增大的趋势（Tab2）.表1100mL/LCSE不同干预时间细胞周期各期细胞所占的百分比（略）表2不同浓度CSE干预24h气道上皮细胞细胞
7、周期各期所占的百分比（略）2.2FIP200mRNA表达100mL/LCSE干预不同时间FIP200mRNA表达水平均有显著增高（P0.05），12h时其增高达高峰，其后表达水平略下降，但与12h组相比无差异（Tab3，Fig2）.不同浓度CSE干预24hFIP200mRNA表达水平均明显增高（P0.01），而且其表达水平随CSE干预浓度的增高而有升高的趋势（Tab4，Fig3）.表3100mL/LCSE不同干预时间细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK结合状态的影响（略）表4不同浓度CSE干预24h对气道上皮细胞FIP200蛋白表达和FIP20
8、0与FKA结合状态的影响（略）2.3FIP200蛋白表达及与FAK的连接100m
