人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

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1、人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定作者：曹玉红,张光运,张国成【摘要】　　目的:构建人β防御素4（humanβdefensin4,HBD4）基因的原核融合表达载体PGEX4T2/mHBD4,诱导GSTHBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体。方法:从重组克隆载体PMD18T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX4T2中,在IPTG诱导下,表达GSTHBD4融合蛋白。以表达的融合蛋白GSTHBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GSTHBD4的

2、抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Westernblot法鉴定。结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32000的融合蛋白GSTHBD4。ELISA法检测抗血清的效价可达到1∶128000,Westernblot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GSTHBD4特异结合。结论:在大肠杆菌中成功表达了GSTHBD4融合蛋白,并制备了GSTHBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础。【关键词】人β防御素4基因克隆融合表达　　[Abstract]AIM:Toconstructthep

3、rokaryoticfusionexpressionvectorofhumanβdefensin4（HBD4）,andtoexpressGSTHBD4fusionproteininEscherichiacoli（E.coli）and12preparepolyclonalantibodyofGSTHBD4.METHODS:ThegeneencodingmaturepeptideofHBD4（mHBD4）wasamplifiedbyPCRfromcloningvectorPMD18T/HBD4whichc

4、ontainedthefulllengthHBD4cDNAandthenclonedintoprokaryoticexpressionvectorPGEX4T2toconstructPGEX4T2/mHBD4.GSTHBD4expressionwasinducedbyIPTG.TheantiserumwaspreparedbyimmunizingrabbitwithGSTHBD4.ThetiterandspecificityoftheantibodyweredetectedbyELISAand

5、Westernblot,respectively.RESULTS:TherecombinantexpressionvectorPGEX4T2/mHBD4wassuccessfullyconstructed.AfterbeinginducedbyIPTG,Thefusionproteinwithrelativemolecularmassof32000wassuccessfullyexpressedinE.coliandpartlyexpressedinthesolubleforminsupernatant

6、.TherabbitantibodyagainstGSTHBD4wasobtained.TheELISAtiterofantiserumagainstGSTHBD4wasabout1∶128000.WesternblotanalysisshowedthattheantiserumcouldbindtotheexpressedGSTHBD4specifically.CONCLUSION:TherabbitantibodyagainstGSTHBD4hasbeensuccessfullyprepared

7、,whichlaysthefoundationforfurtherstudyingthestructureandfunctionofHBD4.　　[Keywords]humanβdefensin4;genecloning;fusionexpression12　　防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽。哺乳动物防御素可分为α、β两类。α防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生,而β防御素广泛表达于多种器官的上皮和黏膜细胞,在使机体免受外界微生物侵袭中有着重要的作用。人类β防御素（humanβdef

8、ensin,HBD）有4种亚型(HBD1～4),具有杀伤细菌、真菌、病毒、原虫及肿瘤以及免疫调节等多重活性,而且不产生细菌耐药性,因此成为国内外众多学者研究的热点[1-3]。国外研究表明,HBD4对多种病原菌有杀灭作用[4]。然而生物体内天然的HBD4含量很低,分离纯化难度大,化学合成成本高。因此利用基因工程技术获得大量HBD4成为必然。目前关于HBD4的体外表达及抗体制备等的相关研究,国内尚未见报道,国外研究亦