不同浓度游离脂肪酸对大鼠系膜细胞外基质基因表达的影响

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1、不同浓度游离脂肪酸对大鼠系膜细胞外基质基因表达的影响作者：魏明卢永申张俊峰李盼盼【摘要】　　目的探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对大鼠系膜细胞外基质基因表达及合成分泌的影响。方法以体外培养大鼠系膜细胞为基础，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子（TGFβ1）mRNA的表达；采用酶联免疫吸附ELISA）试验法检测培养系膜细胞上清液ColⅣ、FN的水平。结果25、100、400μmol/L软脂酸（PA）刺激组ColⅣ、FN、TGFβ1mRNA的表达分别为（0.99±0.18、1.2

2、4±0.16、1.38±0.21）、（0.91±0.13、1.14±0.12、1.28±0.11）和（1.21±0.09、1.43±0.07、1.54±0.06），与0μmol/L对照组比较（0.61±0.17、0.62±0.08、0.81±0.10），差异有统计学意义（均P＜0.01）；25、100、400μmol/LPA刺激组ColⅣ、FN的分泌分别为（59.97±6.48、67.24±6.86、74.38±7.21）ng/ml和（100.91±7.13、135.04±8.12、154.18±9.11）ng/ml，与0μmol/L对照组比较（4

3、8.84±6.17、88.68±8.08）ng/ml，差异有统计学意义（均P＜0.01）。结论FFAs具有促进系膜细胞外基质基因表达和分泌的作用，可能在肾小球硬化病理过程中发挥着重要作用。【关键词】脂肪酸；Ⅳ型胶原；纤维连接蛋白；转化生长因子7　　分别采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术和酶联免疫吸附（ELISA）试验法对系膜细胞外基质Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子β1（TGFβ1）mRNA表达和体外培养合成分泌水平进行检测，旨在探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对系膜细胞外基质ColⅣ、FN、TGFβ1mRN

4、A表达的影响以及其在肾小球硬化发病机制中的作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　RPMI1640培养基及新生小牛血清（FCS）为美国Gibco产品，软脂酸（PA）及小牛血清蛋白（dBSA）为美国Sigma产品。　　1.2细胞培养　　大鼠肾小球系膜（HBZY1）细胞购于郑州大学生理教研室，用含10％FCS、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液制成单个细胞悬液，接种于100ml培养瓶内。当HBZY1细胞长至80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取第11～14代HBZY1细胞用于实验。37℃5％CO21

5、00%湿度条件下培养247h,使细胞处于对数生长期，换成0.5％FCSRPMI1640培养液培养24h使细胞处于静止期。　　1.3实验分组　　吸出孔内培养液，加入PA使终浓度分别为25、100、400μmol/LdBSA，实验重复3次。　　1.4RTPCR体系　　按上述方法分组给药，HBZY1细胞继续培养72h，PBS冲洗3次，加入1mlTrizolRNA提取液，提取细胞总RNA。根据A260/A280值计算总RNA浓度。ColⅣ、FN、TGFβ1mRNA的引物序列见表1。引物由上海生物工程公司合成。在25μl的反应体系中含引物各10pm

6、ol/L，2.5μl的10×buffer，1mmol/LdNTP，1μlTaq酶，变性94℃1min，退火57℃1min，延伸72℃1min，35个循环，72℃延伸2min。表1ColⅣ、FN、TGFβ1mRNA引物序列（略）　　1.5PCR扩增产物电泳　　取扩增产物5μl加载样缓冲液1μl，在含有0.5μg/ml溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶中电泳，标准物为DL2000Marker。通过法国紫外凝胶成像系统分析电泳带灰度。7　　1.6ELISA法检测培养上清液ColⅣ、FN含量　　将5×104/mlHBZY1细胞接种于24孔微量板中培养24h，使细

7、胞处于对数生长期，换成0.5％FCSRPMI1640培养液培养24h使细胞处于静止期。加入软脂酸1ml使终浓度分别为25、100、400μmol/LdBSA，继续培养72h，实验重复3次。　　1.7统计学处理　　数据以x±s表示。对于正态分布的变量应用单因素方差分析，偏相关分析用于在其他变量固定的条件下某两个相关变量相关分析的检验；所有统计学处理均使用SPSS10.0软件进行。　　2结果　　2.1不同浓度PA刺激对HBZY1细胞ColⅣ、FN、TGFβ1mRNA表达的影响　　以25、100、400μmol/LPA刺激后，ColⅣ、FN、TG

8、Fβ1mRNA表达量均明显升高，与0μmol/L对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ColⅣ、FN、TGFβ7