游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞瘦素受体基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化的影响

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1、游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞瘦素受体基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化的影响　　摘要:目的探讨游离脂肪酸是否会对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化产生一定的影响，进而导致胰岛素抵抗及葡萄糖代谢的异常.方法分离、培养新生Sprague-Damol・L-1）或油酸（0.125mmol・L-1）孵育12，24和36h，提取蛋白后用Toinvestigateeffectoffreefattyacidongeneandproteinexpressionandtyrosinephosphorylationofleptinreceptorinr

2、atskeletalmusclecells.METHODSSkeletalmusclecellsneusclecellsitate（0.25mmol・L-1）oroleate（0.125mmol・L-1）for12h，24hand36h，EM培养基购自美国GIBCO公司;胎牛血清为中国医学科学院血液研究所产品;ECL化学发光试剂盒为英国Amersham公司产品.游离脂肪酸灌注液的配制:前述脂肪酸储备液与生理盐水混合，体积比例为1∶10，同时加入肝素10μL（100U・L-1）.　　1.2方法处死新生Spraque-DaL・

3、;L-1胎牛血清的199细胞培养基，37℃培养.待细胞生长并融合时，分别加入含软脂酸（0.25mmol・L-1）或油酸（0.125mmol・L-1）的199培养液，分别培养12，24和36h.同时设立空白对照.裂解细胞后提取蛋白，用BioRad微量蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度.　　1.2.1r120000处可见瘦素受体的杂交条带.经软脂酸和油酸作用12，24h后，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白量与同期对照组相比无显著变化（P>0.05）.经软脂酸和油酸作用36h后，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白量与同期对照组相比及与同组16h相比显著下降（P

4、<0.05）.由数据分析可发现，随着孵育时间的延长，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白水平持续下降（Tab1）.　　表1游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体蛋白水平的影响　略　　2.2游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量的影响根据RT-PCR结果分析，经软脂酸和油酸孵育12h后，骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量与同期对照组相比无显著下降（P>0.05）;经软脂酸和油酸孵育24及36h后，骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量显著下降（P<0.05）;且随时间延长，有继续下降的趋势（Tab2）.　　表3游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞瘦素受体酪氨

5、酸磷酸化的影响　略　　3讨论　　肥胖是Ⅱ型糖尿病非常重要的危险因素［8，9］，肥胖患者普遍存在着脂代谢异常，其脂肪分解速率和血浆游离脂肪酸都是增高的，血浆游离脂肪酸（FFA）是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的一个重要环节［10-12］.瘦素（Leptin）是由1994年首次克隆到的肥胖基因（obesitygene，obgene［13］，位于人类染色体7q32）编码的一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质［14］，是一种脂肪组织源激素，具有广泛的生物效应.瘦素受体基因又叫糖尿病基因（diabetesgene，db），是Leptin的高亲和力受体，瘦素通过与瘦素受体的结合而影

6、响着机体许多生理系统和代谢通路，在控制体脂、能量平衡等方面发挥作用［15］.Leptin受体属于Ⅰ类细胞因子受体超家族，一方面可通过JAK/STAT蛋白发挥作用，受体胞内区（ICD）发生磷酸化，磷酸化的ICD提供了STAT蛋白的结合位点，结合磷酸化受体ICD后STAT蛋白被激活，激活后的STAT蛋白移入核内，刺激胰岛素的转录;另一方面，又可通过有丝分裂原活化蛋白（mitogen-activatedprotein，MAP）和磷脂酰肌醇3激酶（phos-phatidylinositol3-kinase）途径调控能量代谢和体质量平衡.许多研究发现胰岛素与Leptin存在着相互作用［

7、16］.Leptin水平的降低，并不仅仅因为体质量的下降.胰岛素刺激Leptin分泌，Leptin也通过胰岛细胞上的受体来抑制胰岛素的分泌，在胰岛素和Leptin之间存在着一个双向的反馈环.瘦素与胰岛素抵抗之间有密切关系［17，18］.本结果表明，软脂酸和油酸孵育后大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的蛋白表达水平在孵育12和24h后同对照组相比未发生显著变化，但在孵育36h后同对照组相比显著下调;Leptin受体的RNA水平在孵育12h后同对照组相比无显著变化，孵育24和36h后显著下调，说明短时间的高游离