不同浓度sn对aa大鼠滑膜细胞表达课件

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1、正清风痛宁治疗类风湿关节炎临床与作用机制研究国家中医药管理局重点中西医结合风湿病专科第三军医大学西南医院风湿病诊疗中心方勇飞正清风痛宁有效成份为盐酸青藤碱以青风藤为原料提取《本草纲目》称青风藤“主治风疾，风湿流注，历节鹤膝”《本草汇言》记载：“青风藤散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，久服必大建奇功”。。青藤碱的特性青藤碱(sinomenine,SN)是从青风藤根茎中分离提取的一种单体生物碱。药用多为其盐酸盐，分子式C19H23NO4，分子量329.38。从化学结构上看，由氢菲核和乙胺桥组成，结构类似吗啡青藤碱抗炎抑制免疫的机制研究国家自然科学基金（3030045

2、2）、重庆市中医药基金（2003C77）及正清基金资助本项目研究目标与氨甲喋呤（MTX）相比较，初步探讨SN对胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠的关节积分，IFN-γ，抗Ⅱ型胶原抗体的影响初步探讨SN对佐剂性关节炎（AA）及CIA大鼠滑膜细胞表达与分泌IL-1β、TNF-、IL-10的影响；从NF-κB信号通路中相关环节来探讨其具体的抗炎机制及可能的量效关系研究方法本研究分三部分第一部分：建立CIA小鼠关节炎模型，行关节评分；夹心ELISA法检测脾细胞分泌IFN-γ的能力；间接ELISA法检测血清中抗Ⅱ型胶原抗体的水平，同时与MTX相比较第二部分：建立AA及CI

3、A大鼠模型，分离培养大鼠双膝滑膜细胞，运用反转录-PCR检测IL-1β、TNF-、IL-10的mRNA表达、EMSA检测NF-κB的DNA结合活性、免疫印迹检测IκB-的表达，间接免疫荧光法检测P65的核转位情况第三部分：临床研究：ELISA检测RA中IL-1β、TNF-、IL-10及CCP抗体经SN或MTX治疗前后的变化第一部分研究结果正常DBA/1小鼠关节正常（A），其后爪的H&E染色表明无明显的炎细胞浸润（C）。而牛II型胶原可诱发DBA/1小鼠出现关节肿胀、屈曲等关节炎症（B），其后爪的HE染色表明有明显的炎细胞浸润（D）。HEx200建立牛II

4、型胶原诱发DBA/1小鼠关节炎模型治疗分组A.正常小鼠对照组B.CIA：生理盐水治疗组(阴性对照组)C.CIA：MTX0.4mg/kg•w治疗组(阳性对照组)D.CIA：MTX0.4mg/kg•w+SN7.5mg/kg•d治疗组E.CIA：SN7.5mg/kg•d治疗组F.CIA：SN15mg/kg•d治疗组正常对照组小鼠未出现关节炎性改变，其他各组均有不同程度的关节炎症表现。从初次免疫后第28天起，MTX组、MTX+SN组、SN小剂量组、SN大剂量组小鼠关节评分均低于对照组。其中，MTX+SN组关节评分最低不同治疗组小鼠脾淋巴细胞体外刺激后分泌IFN-γ水平

5、生理盐水对照组IFN－γ水平明显高于正常对照组(P<0.05)；各治疗组IFN－γ水平均低于生理盐水对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两单个SN治疗组均高于MTX组生理盐水对照组抗Ⅱ型胶原抗体水平高于正常对照组(1:10和1:100两个稀释水平P<0.05)；各治疗组中抗Ⅱ型胶原抗体水平均低于生理盐水对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两个SN治疗组均高于MTX组，与生理盐水对照组无显著差异第一部分初步结论无论大剂量还是小剂量应用SN治疗CIA，其改善炎症症状、抑制IFN－γ和抗Ⅱ型胶原抗体的能力均不及经典抗风湿药物-MTX但SN与MTX联合治疗CI

6、A优于其它SN或MTX单独使用的治疗方案第二部分研究结果胶原诱导型关节炎大鼠模型建立正常对照大鼠CIA模型大鼠正常大鼠与胶原诱导性关节炎大鼠后肢踝关节滑膜病理图片正常大鼠（HEx400）CIA大鼠（HEx400）滑膜细胞的培养和鉴定(倒置相差显微镜x100)(倒置相差显微镜x200)滑膜细胞的培养和鉴定传代培养的大鼠滑膜细胞电镜图片(透射电镜x4000)不同浓度SN对AA大鼠滑膜细胞表达TNF-α、IL-1β及IL-10mRNA的影响RT-PCR图像显示，正常对照组滑膜细胞均有较弱的TNF-αmRNA、IL-1βmRNA及IL-10mRNA的表达，而这三种细胞

7、因子在AA大鼠的表达较正常对照组均明显升高（P0.05）随着青藤碱的体外剂量浓度逐渐从30g/ml增加至120g/ml时，TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达呈浓度依赖性地下降，而IL-10mRNA的表达亦呈下降趋势，但无浓度依赖性大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达TNF-αIL-1βControlAASIN30μg/mlSIN60μg/mlSIN120μg/mlMarker大鼠滑膜细胞IL-10mRNA的表达IL-10Β-actinContrlAASIN30μg/mlSIN60μg/mlSIN120μg/mlMarker不

8、同剂量SN对AA大鼠滑膜细胞内NF-κ