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1、通络宁心方对人脐静脉内皮细胞保护作用的实验研究论文.freelanumbilicalveinendothelialcells.MethodsTocultivateendothelialcellsandprepareserumlyseparatedinto8groups,normalgroup,modelgroup,.freelediumdose,loediumdose,loalgroup,add30%H2O2totheothergroups,andmakeendothelialcellsdamagedmodels
2、.Addserumodelgroupalgroup,alltreatgroupsandallcontrolgroups.ET-1ofmodelgroupodelgroupalgroup,treatgroups(smediumdose,loediumdose).Ithadnosignificantdifferenceparedodelgroup,treatgroup(highdose)andcontrolgroup(loeinfluenceasFufangdanshendamageinducedbyH2O2.Key
3、anumbilicalveinendothelialcells；experimentalresearch不稳定性心绞痛(UA)是指介于稳定性心绞痛(SA)和急性心肌梗死(AMI)之间的一组临床心绞痛综合征,属于急性冠脉综合征(ACS)的表现形式。UA作为冠心病心绞痛的特殊类型,当属于中医学“胸痹”、“心痛”的范畴。血管内皮损伤被认为是动脉粥样硬化(AS)的始动因素。血管内皮功能紊乱所引起的继发性血管痉挛、血栓形成、斑块破裂在UA的发生、发展过程中占有重要地位。本课题组以温阳药为主配伍养阴药组成通络宁心方治疗UA,
4、取得良好效果。本研究以过氧化氢(H2O2)所致体外人脐带静脉内皮细胞损伤模型为研究对象,通过检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、P-选择素(Ps)来观察通络宁心方对血管内皮细胞分泌作用的影响,并以复方丹参滴丸作为阳性药对照,验证通络宁心方的作用机理。1实验材料1.1培养细胞人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株(ECV-304细胞),购自中国科学院典型培养物保藏委员会。1.2药物通络宁心方由麻黄、附子、细辛、麦冬、玉竹等中药组成,所有药材均由盐城市中医院提供,并经南京中医药大学中药鉴定室鉴定,确定其科属符合实
5、验用药要求。复方丹参滴丸,天津天士力制药股份有限公司生产。1.3主要试剂RPMI-1640培养基(GIBCO,USA)、胰蛋白酶(Tprin,1﹕250,Amerso,USA)、小牛血清(杭州四季青)、30%H2O2(分析纯,镇江市化剂厂,批号2000109,临用时配成1000mmol/L的溶液,用孔径0.44μm的滤膜过滤除菌备用)、NO试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)、ET放免药盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免所)、Ps试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)。2实验方法2.1动物含药血清的制备日本大
6、耳兔,体重1.8～2.5kg,雌雄不拘,本校动物实验中心提供,合格证：苏动质97003。药物组分别给家兔灌胃相应药物(通终宁心方煎剂、复方丹参滴丸),每天2次,连续灌胃4d。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h)无菌条件下颈动脉取血,离心,分离血清,56℃、30min灭活,0.45μm的微孔滤膜过滤除菌,密封后置于-20℃冰箱保存备用。2.2ECV-304的培养将ECV-304接种于25cm2玻璃培养瓶中,加15%的小牛血清的RPMI-1640培养基,置5%的CO2培养箱中37℃培养。每周用0.25%胰蛋白酶
7、消化传代2～3次。将生长良好的ECV-304用0.25%的胰蛋白酶消化,轻轻吹打,制成细胞悬液,调整细胞浓度为5×106/mL,接种于6孔板中。待细胞长满后(约24h),弃去上清液。2.3造模及给药将呈对数生长期的血管内皮细胞分为8组：正常组,模型组,大、中、小剂量治疗组,大、中、小剂量对照组。除正常组外,其余7组予0.3mL30%H2O2造模；治疗组、对照组分别予0.6、0.3、0.15mL相应的含药血清；8组均将加入0.3mL小牛血清及适量的RPMI-1640液使各组总液体量达3mL；上述操作完成后,置于37
8、℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。每隔6h用倒置相差显微镜观察。24h后,取各组培养液,置于-20℃冰箱中保存待测。2.4检测方法NO的测定：取各组培养液,采用硝酸还原酶法测定NO。ET-1的测定：取各组培养液2mL,注入含10%乙二胺四乙酸二钠30μL和抑肽酶40μL的试管中,混匀,4℃,3000r/min离心10min,取上清,-70℃保存备用,采用放射免疫
