mirna4530在人脐静脉内皮细胞中作用的研究

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1、万方数据温州医科大学硕士毕业论文miRNA．4530在人脐静脉内皮细胞中作用的研究中文摘要第一部分miR-4530靶基因的预测分析及3"UTR验证目的通过生物信息学软件TargetScanHuman6．2预测分析miR-4530的靶基因并筛选出作为研究对象的靶基因，将miR-4530质粒与携带有靶基因的3、UTR序列的荧光素酶报告载体(psiCHECK一2)的重组质粒共转染人肾上皮细胞(293T细胞)，利用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，分析miR．4530与靶基因之间是否存在靶向性的结合。方法1)使用生物信息学软件Tar

2、getScaHuman6．2预测分析，筛选出与miR-4530相关性最高的5个靶基因。2)将含有己确定靶基因的3、UTR的重组质粒分别与miR-4530质粒、NC质粒和空白对照(不含质粒)共转染293T细胞。3)通过双荧光素酶报告基因系统检测miR一4530与相应靶基因是否存在靶向性结合关系。结果11通过生物信息学软件TargetScanHurnan6．2筛选出miR-4530对应的5个相关性高的靶基因包括：RASAl(RASp21proteinactivator1)、PTCD3(Pentatricopeptiderepeat

3、domain3)、PANKl(Pantothenatekinase1)、FGFRl(Fibroblastgrowthfactorreceptor1)和VASHl(Vasohibin1)，通过查阅文献并确定VASHl为靶基因。2)双荧光素酶报告基因实验显示，共转染组的荧光素酶活性分别与NC组和对照组相比，荧光素酶的活性均出现降低，有非常显著的统计学差异(P<0．001V．S．NC，P<0．001V．S．空白对照)。结论筛选出miR-4530可能的5个相关性高的靶基因，并通过查阅文献，最终确定靶基因为VASHl。双荧光素酶报告基因

4、实验显示，过表达miR．4530质粒可以万方数据温州医科大学硕士毕业论文与VASHl的3’UTR全序重组质粒特异性结合，并抑制下游荧光素酶的表达，确定VASHl是miR-4530的直接靶向基因。第二部分miR．4530对HUVEC细胞管腔形成的影响目的将miR．4530mimics、mimicsNC、miR．4530inhibitor、inhibitorNC分别转染HUVEC细胞后，通过基质胶成管实验观察miR一4530是否对HUVEC细胞管腔形成能力产生影响。方法1)通过HUVEC细胞转染不同浓度NC．FAM，观察转染后的荧

5、光确定最适合的转染浓度。2)HUVEC细胞分别转染miR-4530mimics、mimicsNC、miR．4530inhibitor、inhibitorNC与空白对照。3)用Mafigel基质胶孵育转染完成的HUVEC细胞，观察转染miR一4530mimics和miR-4530inhibitor后对HUVEC细胞管腔形成能力的影响，来验证过表达miR-4530和抑制miRM530分别对HUVEC细胞生物学功能的作用。结果1)通过观察HUVEC细胞转染NC．FAM的荧光强度，确定最适的转染浓度为6孔板中30pmoV孑L。2)HU

6、VEC细胞转染miR一4530mimics、mimicsNC、miR一4530inhibitor、inhibitorNC与空白组后，通过MNfigel基质胶成管实验，观察到转染miR一4530mimics组分别与mimicsNC组和对照组相比管腔的形成数量减少，存在统计学差异(P<0．05V．S．mimicsNC，P<0．05V．S．空白对照)。转染miR．4530inhibitor组分别与inhibitorNC组和对照组相比管腔的形成数量增加，存在统计学差异(P<0．05v．S．inhibitorNC，P<0．05v．s．空

7、白对照)。结论通过Matfigel基质胶培养HUVEC细胞的管腔形成能力实验，发现过表达miR一4530可以抑制管腔形成，抑制miR．4530可以促进管腔形成。说明转染miR．4530的确对HUVECs的管腔形成的能力产生了影响。第三部分HUVEC细胞转染miR-4530和miR．4530Sponge对VASH．1表达情况的影晌万方数据温州医科大学硕士毕业论文目的miR一4530增强子质粒、miR-4530Sponge抑制子质粒和NC质粒分别转染HUVEC细胞，分别在VASHl‘的mRNA和蛋白水平验证miR．4530对其表达

8、情况的影响。方法1)使用灭瘟素筛选HUVEC细胞，确定最适合的筛选浓度。2)转染miR-4530增强子质粒、miR-4530Sponge抑制子质粒和NC质粒，通过使用灭瘟素筛选，构建稳转的细胞株。3)筛选出miR-4530过表达、低表达和NC细胞株后，通过荧光定量PCR和We