人脐静脉内皮细胞缺氧早期基因表达谱研究

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1、人脐静脉内皮细胞缺氧早期基因表达谱研究查看全文下载全文导出添加成功！您可以在“我的服务”中查看您添加的引用通知列表，并且配置获取通知的方式。关闭一、方法1．制作脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)缺氧模型，检测常氧和缺氧1h、3h、6h、12h各时相点ICAM-1、HIF-1α蛋白表达情况。2．将细胞分为常氧组和缺氧3h组，分别提取总RNA，依照Invitrogen公司LongSAGEkit说明，构建常氧和缺氧3h脐静脉内皮细胞LongSAGE文库，具体操作简述如下：制备mRNA，合成cDNA双链，锚定酶酶切后的cDNA片段等分两份，分别与A、

2、B接头连接；然后以标签酶酶切，并连接形成双标签；PCR扩增，分离纯化双标签；双标签随机连接形成串联子并将其克隆至pZero载体中，测序。测序结果经软件分析，获得标签序列及丰度信息，通过与Genbank数据库比对确认基因。3．生物信息学分析：通过NCBIftp://ftpl.nci.nih.gov/pub/SAGE/HUMAN/Hslong.bestgene.gz平台分析去除多重匹配标签中的冗余标签，统计差异表达P值<0.05的有意义标签，纳入后续分析(信号途径活化分析除外)；根据单一匹配有意义标签在2个LongSAGE文库中差异表达，总结缺氧后

3、表达明显上调和下调的基因；通过制作MA散点图了解缺氧和常氧两个SAGE文库中标签的分布情况；制作常氧和缺氧脐静脉内皮细胞基因表达图谱；采用在线数据库(http://www.discover.nci.nih.gov/gominer/)，基于GO(GeneOntology，有译为“基因本体”或者“基因注释”)生物信息学系统，对SAGE文库中P值小于0.05的差异表达基因进行了基因功能注释和分类；基因富集分析采用PERL程序(geneid2path.pl)，通过KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)平台预测分

4、析缺氧早期血管内皮细胞信号通路与生化途径改变。4．常氧和缺氧脐静脉内皮细胞基因表达谱的验证：RNA水平的验证采用荧光定量PCR，对SAGE文库中随机挑选的5个已知基因进行验证，比较缺氧后其在RNA水平变化是否与SAGE文库中所得结果相符。采用结合标签的基因序列延伸(GLGI)技术对从文库中选取的3个无匹配标签进行扩增，确定其是否属于未知新基因。与常氧和缺氧基因表达谱相关蛋白质验证采用Westernblot检测缺氧后VEGF、PCNA蛋白表达变化。与常氧和缺氧基因表达谱相关细胞功能验证采用细胞计数绘制缺氧前后细胞生长曲线、流式细胞仪分析缺氧后细胞

5、周期改变、以及AnnexinV方法检测短暂缺氧后细胞凋亡发生率，对缺氧早期促细胞增殖和凋亡效应等方法进行验证。5．Westernblot检测缺氧后血管内皮细胞Integrinβ1蛋白表达变化；转染Integrinβ1全长启动子荧光素酶报告基因至细胞，转染48h后行缺氧3h处理，检测缺氧前和缺氧后不同时间Integrinβ1启动子活性变化；构建Integrinβ1荧光小RNA干扰载体，转染EA.hy926细胞，筛选稳定低表达细胞株，通过绘制常氧、缺氧状态下正常EA.hy926细胞和下调表达细胞株生长曲线，对Integrinβ1在缺氧早期促血管内皮

6、细胞增殖效应中的作用进行了初步研究。二、结果1．通过LongSAGE技术构建了常氧和缺氧脐静脉内皮细胞LongSAGE文库，缺氧SAGE文库测得30,756个标签，其中识别出的基因(即uniquetag)总数为13879，比例为45.13％；重复的双标签体总数为762，比例为2.40％。常氧SAGE文库测得标签数为31213，其中识别出的基因总数为13665，比例为43.78％；重复的双标签体总数为758，比例为2.40％。文库中共有112个基因表达量出现明显差异(P<0.05)，涵盖编码细胞代谢酶类，核糖体蛋白，生长因子，转录和翻译调节因子等

7、，其中缺氧后明显上调的基因为62个，包括信号转导和转录调节因子GPCR5A和C11ORF13，以及促血管生成因子ANGPLT4等；而显著下调基因为50个，包含参与离子结合和防御反应的基因如HMOX1、SOD1、FTH1、CTGF、OTUB1等；这些基因被视为缺氧后有显著差异表达的基因，纳入后续生物信息学分析中。2．生物信息学分析：综合基因富集分析和GO分析结果，发现缺氧早期由于负调控增殖基因群的表达受到明显抑制(共有4个负调控基因出现显著差异表达，其中CAV1，GJA1，HMOX1表达下调，NME1表达上调)，总趋势是促进细胞增殖；另外，缺氧早

8、期P13K通路被显著激活，而TGF-β受体和Notch信号通路被抑制。由于抗凋亡基因(HSPA1A，ANXA1，CFL1，HMOXl)表达明显下调，促