清热益气通络方对糖尿病肾病大鼠足细胞保护作用的研究

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1、成都中医药大学博士学位论文成都中医药大学二0一四届博士研究生学位论文清热益气通络方对糖尿病肾病大鼠足细胞保护作用的研究ProtectiveEffectsofQingreYiqiTongluoFangonPodocyteInjuryinratswithDiabeticKidneyDisease研究生姓名：朱海慧指导教师：叶学锋学科专业：中西医结合临床二○一四年五月1万方数据成都中医药大学博士学位论文学位论文清热益气通络方对糖尿病肾病大鼠足细胞保护作用的研究朱海慧指导教师姓名：叶学锋申请学位级别：博士专业名称：中西医结合临床

2、论文提交时间：2014-5-6论文答辩时间：2014-5-21二○一四年五月2万方数据成都中医药大学博士学位论文中文摘要目的：研究清热益气通络方对实验性糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的治疗作用及其机制。方法：采用单侧肾切除链脲佐菌素腹腔注射方法制备糖尿病肾病大鼠模型。将糖尿病肾病大鼠的分为3组：模型组（n=10）、中药组（n=9）、厄贝沙坦组（n=8），另设正常对照组（n=10）。连续治疗12周，观察各组大鼠：①肾/体重指数、24h微量白蛋白量、24h尿蛋白量、血肌酐、尿素氮。②光镜及透射电镜观察分析肾组织病理形态变化，测量肾

3、小球横截面积、系膜区面积、系膜区面积/肾小球横截面积比值、肾小球基底膜厚度、足突平均宽度、足突融合率；③免疫组化法对肾小球足细胞表面特异性蛋白podocalyxin、P钙黏蛋白(P-cadherin)、结蛋白（desmin）、成纤维细胞特异蛋白1(FSP1)进行染色标记，免疫荧光双标记podocalyxin/desmin、P-cadherin/FSP1，观察两组共表达情况及表达强度；④免疫荧光标记足细胞肾胚胎瘤抑制基因(WT1)，计数WT1阳性足细胞数及密度；⑤酶联免疫吸附法检测肾皮质氧化应激指标超氧歧化酶、过氧化氢酶、

4、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽、丙二醛含量。结果：①模型组大鼠肾/体重指数、24h尿蛋白、24h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮显著高于正常组（P<0.01）；中药组大鼠以上指标均显著低于模型组大鼠（P<0.01或P<0.05），中药组24h尿蛋白量显著低于厄贝沙坦组大鼠（P<0.05）。②模型组大鼠肾小球横截面积、系膜区、足突宽度、足突融合率及基底膜厚度均高于正常组大鼠（P<0.01或P<0.05）；中药组大鼠球横截面积、系膜区、足突宽度、足突融合率及基底膜厚度与模型组比明显较低（P<0.01或P<0.05），中药组M

5、A明显较低（P<0.05）；中药组大鼠足突融合率低于厄贝沙坦组大鼠（P<0.05）。③免疫荧光双标记染色显示，正常组大鼠肾小球内未见有两组蛋白抗体共同标记染色，糖尿病肾病大鼠出现大量两组蛋白抗体共同标记染色现象；DKD大鼠肾小球podocalyxin、P-cadherin表达强度显著低于正常组（P<0.01），FSP1、Desmin表达强度高于正常组（P<0.01）；与模型组比，中药组肾小球podocalyxin、P-cadherin表达强度显著较高（P<0.01或P<0.05），FSP1、Desmin表达强度明显较低（

6、P<0.01或P<0.05）；与厄贝沙坦组比，中药组podocalyxin表达强度较高、FSP1表达强度较低3万方数据成都中医药大学博士学位论文（P<0.05）。④与正常组比，糖尿病肾病大鼠肾小球WT1阳性足细胞计数无明显减少（P>0.05），肾小球内足细胞密度较小(P<0.01)；中药组足细胞密度显著大于模型组（P<0.01）。⑤与正常组相比，模型组大鼠丙二醛含量较高(P<0.01)，还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧歧化酶、过氧化氢酶水平较低(P<0.01)；与模型组比，中药组大鼠肾皮质丙二醛含量较少（P<0.

7、01），还原型谷胱甘肽、超氧歧化酶、过氧化氢酶水平较高（P<0.01或P<0.05）；中药组大鼠肾皮质超氧歧化酶、过氧化氢酶高于厄贝沙坦组大鼠（P<0.05）。结论：①清热益气通络方药能降低糖尿病肾病大鼠24h尿微量白蛋白、24h尿蛋白排泄及血肌酐、尿素氮，能减轻DKD大鼠肾小球病理损害。②该实验时限内糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞计数无明显减少，足细胞密度降低，足细胞表型发生变化（podocalyxin、P-cadherin表达强度减弱，FSP1、Desmin表达强度增强），清热益气通络方药能减轻这一变化；③清热益气通络方药

8、能提高DKD大鼠肾组织抗氧化物质SOD、CAT、GSH含量，减少MDA，减轻局部氧化应激损伤。这种作用至少是其拮抗足细胞表型改变的部分机制。④清热益气通络方药保护足细胞作用是其治疗DKD大鼠蛋白尿的重要作用靶点。关键词：糖尿病肾病；清热益气通络方；足细胞表面特异性蛋白；P钙黏蛋白；结蛋白；成纤维细胞特异蛋白；肾胚胎瘤