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《益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织wt1影响的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
河南中医学院２０１３届硕士研究生学位论文益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究研究生姓名：宋丹丹导师：宋纯东副教授指导组成员：喻青教授彭贵军博士王峥博士学科、专业：中医内科学所属院、部：第一临床医学院中国﹒郑州２０１３年４月３０日 硕士学位论文原创性声明本人所呈交的硕士学位论文，是在导师宋纯东教授的指导下，独立进行科学研究工作所取得的成果。除文中已特别加以注明引用的内容外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。特此声明。论文作者（签名）：年月日硕士学位论文使用授权声明本人已完全了解河南中医学院有关保留、使用硕士学位论文的相关规定，同意学校保留或向国家有关部门、机构送交本学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权河南中医学院可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本论文（注：保密论文在解密后适用本授权声明）。特此声明。论文作者（签名）：导师（签名）：年月日年月日 目录中英文缩略词对照....................................................................................................1摘要...........................................................................................................................1Abstract.....................................................................................................................3前言...........................................................................................................................6材料与方法...............................................................................................................81实验材料........................................................................................................82实验方法......................................................................................................113统计学处理..................................................................................................13结果.........................................................................................................................14讨论.........................................................................................................................211.中医对DN的认识........................................................................................212.糖尿病大鼠的造模方法和糖尿病肾病的形成.............................................223.糖尿病肾病的足细胞与蛋白尿....................................................................234.WT1和肾小球功能.....................................................................................235.结果与分析...................................................................................................256.思考与展望...................................................................................................25结论.........................................................................................................................27参考文献.................................................................................................................28致谢.........................................................................................................................31附录1病理照片.....................................................................................................33附录2文献综述.....................................................................................................35综述一糖尿病肾病的中医药研究.................................................................35综述二WT1与糖尿病肾病..............................................................................40附录3在校期间论文论著和科研情况..................................................................45 中英文缩略词对照中文名称英文名称缩略词糖尿病肾病diabeticnephropathyDN糖尿病diabetesmellitusDM肾母细胞瘤抑制基因wilms’tumor1geneWT124h尿蛋白定量24-hoururinaryprotein24-hrUP血肌酐serumcreatinineScr尿素氮BloodUriaNitrogenBUN血白蛋白serumalbuminALB谷丙转氨酶alanineaminotransferaseALT总胆固醇totalcholesterolTC甘油三酯triglyceridesTG空腹血糖fastingbloodglucoseFBG链脲佐菌素streptozotocinSTZ肾小球基底膜glomerularbasementmembraneGBM细胞外基质extracellularmatrixECM裂孔隔膜slitdiaphragmSD 摘要摘要研究背景及目的：糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）最常见的，最严重的微血管并发症。DN的发病机制非常复杂。蛋白尿是肾损害的一个标志，也是促进肾脏疾病进展的重要因素。蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障足细胞的损伤关系密切。足细胞和足细胞伸出的足突及足突和足突之间的裂孔膜（slitmembrane）是肾小球滤过屏障的最外层。日本的学者研究DN患者尿液中的足细胞，并通过研究足细胞的数量来观察足细胞的损伤，然因足细胞和肾小球结构的复杂性，在现行的条件下用光学显微镜来测量足细胞的数量是非常困难的。尿足细胞检测，不适用于临床研究。肾母细胞肿瘤1（WT1）仅表达在足细胞核，参与维持足细胞的功能，是足细胞的特异性标志之一，因此我们选取WT1作为我们的观察指标。DN据其临床表现及病机特点，属于中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”等的范畴。其基本病因为先天禀赋不足，后天饮食不节，劳欲太过及情志失调。近来大多数医家都认为DN的基本病机为气阴两虚，在疾病的发展过程中可伴有血瘀、痰浊（湿）、湿（痰）热等，虚实夹杂，互相影响，共同加重疾病病情。治疗上益气养阴活血类中药起到了较好的疗效。在既往课题组研究的基础上，本实验通过建立DM大鼠模型，待其发展为DN，采用导师宋纯东教授临床经验方剂益气养阴活血方对该模型进行干预，并通过观察实验大鼠的24h尿蛋白定量，血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG），肾组织病理学形态及肾组织中WT1的表达情况，研究益气养阴活血方对DN的治疗作用及其有效机制，为临床广泛应用益气养阴活血方提供实验基础和理论依据。方法：选用清洁级雄性SD大鼠60只，适应性喂养一周，随机分为5组：空白组、模型组、代文组、高剂量组和低剂量组，称重后造模各组给予链脲佐菌素（STZ）45mg/kg单次腹腔注射，空白组给予同等剂量新鲜配制的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，3天后连续监测血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖阳性，尿蛋白阳性，尿量大于正常组1 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究150%者为造模成功。成模后空白组和模型组灌服生理盐水（1ml/100g），代文组按1.67mg/200g•d灌服给药，高剂量组、低剂量组按成人用药量的12.5倍、6.25倍给药，各组共给药6周。6周后，观察益气养阴活血方对DN大鼠的一般情况，肥大指数，24h尿蛋白定量、Scr、BUN、ALB、ALT、TC、TG和FBG等生化指标的影响。同时PAS染色光镜下观察肾脏病理变化，免疫组化检测肾组织中WT1的表达。结果：益气养阴活血方能够改善实验大鼠的一般情况。肥大指数方面，空白组与各造模组之间均存在显著性差异（P<0.01），代文组（5.56±0.35）与高剂量组（3.92±0.35）、低剂量组（4.61±0.39）比较有差异（P<0.01）。实验结束时各造模组大鼠的ALT、BUN、Scr均无显著性差异（P>0.05）。空白组ALB与各造模组比较，有显著性差异（P<0.01）；代文组（18.28±0.90）与模型组（16.99±0.69）比较有差异（P<0.05），与高剂量组（21.80±1.16）、低剂量组（20.81±0.99）比较有显著性意义（P<0.01）；高、低剂量组比较，无显著性差异（P>0.05）。在TC方面，空白组（1.39±0.26）与代文组、模型组、低剂量组相比，有显著性差异（P<0.01），与高剂量组（1.62±0.09）无差异（P>0.05），代文组（2.08±0.20）与模型组（2.09±0.22）无显著性差异（P>0.05）。空白组（1.12±0.38）的TG与各造模组有显著性差异（P<0.01或P<0.05），代文组（3.32±0.37）与模型组（3.60±0.68）无差异（P>0.05）。空白组大鼠的24h尿蛋白定量（0.0371±0.0166）与高剂量组（0.0553±0.0075）比较无明显差异（P>0.05）；代文组（0.0834±0.0167）与低剂量组（0.0802±0.0121）无明显差异（P>0.05）。免疫组织化学结果：WT1在各组足细胞细胞核表达，与空白组比较，造模组WT1的表达明显减少，具有显著性差异（P<0.01）；造模各组中模型组WT1的表达最少，与代文组、高剂量组、低剂量组的差异有显著性意义（P<0.01）。结论：1.益气养阴活血方可以减少尿蛋白，保护肾功能。2.益气养阴活血方可以抑制DN大鼠的肾小球毛细血管基底膜的增厚、系膜基质增生及足细胞的病变，延缓肾脏病理的进展。3.益气养阴活血方可以影响肾组织中WT1的表达。关键词：糖尿病肾病；益气养阴活血方；足细胞；WT1；2 AbstractResearchofyiqiyangyinhuoxueprescriptionontheimpactofWT1ofdiabeticnephropathyratinkidneytissueSongDandan（InternalMedicineofTraditionalChineseMedicine）DirectedbySongChundongAbstractTheresearchbackgroundandobjective:Diabeticnephropathyisthemostcommondiabetes,butalsothemostseriousmicrovascularcomplicationsofdiabetes.ThepathogenesisofDNisverycomplicated.Proteinuriaisasignofkidneydamage,itisalsoanimportantfactorinpromotingtheprogressionofkidneydisease.Productionofproteinuriaiscloselyrelatedtoglomerularfiltrationbarrierofpodocyteinjury.Podocytes、podocyte’soutstretchedfootprocessandtheslitmembranebetweenthefootprocessesandfootprocessesistheoutermostlayeroftheglomerularfiltrationbarrier.JapanesescholarsstudypodocytesintheurineofpatientswithDNandthroughtheresearchofpodocytenumbertoobservetheinjuryofpodocytes.However,duetothecomplexityofthestructureofpodocyteandglomerular,undertheexistingconditionswithanopticalmicroscopetomeasurethenumberofpodocytesisverydifficult.Urinarypodocytedetection,doesnotapplytoclinicalresearch.Wilms'tumor1(WT1)expressiononlyinthenucleus,involvedinmaintainingpodocytefunction,isoneofthehallmarksofpodocyte-specific,sowechooseWT1asindicatorsofourobservations.DN,accordingtoitsclinicalmanifestationsandpathogenesischaracteristics,belongstoTCM"Diabetes","edema","urineturbid",etc.Thebasiccauseofisbecauseoflackofinnateendowment,acquiredimproperdiet,lowedesiretooandemotionaldisorders.Recently,mostphysiciansbelievedthatthebasicpathogenesisofDNbothqiandYindeficiency.Intheprocessoftheprogressofthediseasemaybeaccompaniedbybloodstasis,phlegmturbidity(wet),wetheat(sputum),etc.,.Factorsthatinfluenceeachother,mutualaggravatingillness.Ontreatment,Chineseherbsofyiqiyangyinhuoxuehasplayedagoodcurativeeffect.Onthebasisofexistingresearch,thisexperimentisthroughtheestablishmentoftheDMbigratmodel,forthedevelopmentofDN,adoptingtutorprofessorSongChundongfromprescriptionyiqiyangyinhuoxueprescriptionstointerveneinthis3 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究model.Andbyobservingthe24-hurineproteinquantitativeexperimentinrats,serumcreatinine,bloodureanitrogen,serumalbumin,alanineaminotransferase,totalcholesterol,triglycerides,fastingbloodglucose,kidneypathologymorphologyandtheexpressionofWT1inrenaltissue,tostudytheeffectofyiqiyangyinhuoxueprescriptionsonDNanditseffectivemechanism,widelyusedyiqiyangyinhuoxueprescriptionsforclinicalprovidestheexperimentalbasisandtheoreticalbasis.Method:Choosingcleanlevel60maleSDrats,adaptivefeedingforaweek,wererandomlydividedinto5groups:Blankgroup,Modelgroup,Diovangroup,HighdosegroupandLowdosegroup.Afterweighingmodelinggroupsweregiven45mg/kgsingleintraperitonealinjectionofstreptozotocin.Blankgroupwasgiventhesamedoseoffreshpreparedbyintraperitonealinjectionofsodiumcitratebuffer.After3days,continuousmonitoringofbloodglucose,bloodglucose≥16.7/mmoL,glycosuria,positiveurineprotein,urinevolumeisgreaterthannormalgroup150%formodelingsuccess.Aftermodelingsuccess,BlankgroupandModelgroupwerefedwith0.9%salinesolution(1ml/100g).Diovangroupaccordingto1.67mg/200g•dweregivenmedicine.Highdosegroup,Lowdosegroupaccordingtotheadultdoseof12.5times,6.25times,weregivenmedicine.Eachgroupweregivenmedicinefor6weeks.Aftersixweeks,observetheeffectofyiqiyangyinhuoxuprescriptionsongeneralsituationofDNrats,hypertrophyindex,24hurinaryproteinquantitative,Scr,BUN,ALB,ALT,TC,TG,FBG,andotherbiochemicalmarkers.AtthesametimePASstainingofrenalpathologicalchangeswasobservedbylightmicroscopy.WT1expressionintherenaltissueswasdetectedbyimmunohistochemistry.Result:Hypertrophyindex,betweenBlankgroupandModelgroupthereweresignificantdifferences(P<0.01),Diovangroup(5.56+0.35)(3.92+0.35)andHighdosegroup,Lowdosegroup(4.61+0.39)differ(P<0.01).EndattheofexperimenteachmoduleintheratofALT,BUN,Scr,therewasnosignificantdifference(P>0.05).InALB,Blankgroupwiththemoduletocompare,thereissignificantdifference(P<0.01);Diovangroup(18.28+0.90)comparedwithmodelgroup(16.99+0.69)differ(P<0.05);andHighdosegroup(21.80+1.16),Lowdosegroup(20.81+0.99)hasasignificantmeaning(P<0.01);HighandLowdosegroup,therewasnosignificantdifference(P>0.05).InTC,Blankgroup(1.39+0.26)andDiovangroup,Modelgroup,Lowdosegroup,withsignificantdifference(P<0.01),andHighdosegroup(1.62+0.09)nodifference(P>0.05).Diovangroup(2.08±0.20)withthemodelgroup(2.09±0.22)hadnosignificantdifference(P>0.05).In4 AbstractTG,Blankgroup(1.12±0.38)andthemodulehasmadeasignificantdifference(P<0.01orP<0.05),Diovangroup(3.32±0.37)withthemodelgroup(3.60±0.68)nodifference(P>0.05).Blankgrouprats24hurineprotein(0.0371±0.0166)andHighdosegroup(0.0553±0.0075)showednosignificantdifference(P>0.05);Diovangroup(0.0834±0.0167)andlow-dosegroup(0.0802±0.0121)nosignificantdifference(P>0.05).Immunohistochemistryresults:WT1inpodocytesnuclearexpressionofeachgroup,comparedwithBlankgroup,Modelgroup,WT1expressionwassignificantlyreduced,withasignificantdifference(P<0.01);ModeleachgroupofWT1expressioninmodelgroup,atleast,withDiovangroup,highdosegroupandlowdosegroupdifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).Conclusion:1.Yiqiyangyinhuoxueprescriptionsmayreduceurinaryproteinandprotectrenalfunction2.YiqiyangyinhuoxuprescriptionscaninhibittheDNratglomerularcapillarybasementmembranethickening,mesangialmatrixproliferationandcellsofthepathologicalchanges,delaytheprogressofrenalpathology.3.YiqiyangyinhuoxueprescriptionscaninfluencetheexpressionofWT1inrenaltissue.Keywords:Diabeticnephropathy,Yiqiyangyinhuoxuprescriptions,Podocyte,WT15 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究前言DN是导致终末期肾脏疾病（end-stagerenaldisease，ESRD）的主要独立因素，其发病率高，作用机制复杂，治疗棘手，疗效差，危害极大。DN的临床特点是蛋白尿和进行性肾功能不全。DN组织学特征的两个特点为系膜增生和肾小[1]球基底膜（glomerularbasementmembrane，GBM）增厚。目前，对于细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的合成和GBM增厚已有较深层次的研究。大量的细胞因子，如转化生长因子-β、血管紧张素Ⅱ、结缔组织生长因子等都与这些[2-4]病理生理改变相关。然而，这些研究都不能完全解释DN患者异常蛋白尿的发生、发展。近来，越来越多的证据表明足细胞是DN蛋白尿的形成和发展的重要参与者。Steffes等人发现，各个年龄段的1型糖尿病患者，足细胞数量较少，即使是在较[5]短时间内的糖尿病，足细胞数量也会减少。日本的学者在尿液中发现了足细胞，在此基础上进一步研究发现53％的2型糖尿病患者有微量白蛋白尿，80％的2型[6]糖尿病患者有大量蛋白尿。这些研究都提供了令人信服的证据证明足细胞病变在蛋白尿发展存在之前就已经存在。而且在这些研究中都涉及到了通过对足细胞数量的研究来观察足细胞的损伤，然而因为足细胞和肾小球结构的复杂性，在现行的条件下用光学显微镜来测量足细胞的数量是非常困难的，不适用于临床研究。因此，发现一种方便的标记，来研究肾脏疾病患者的足细胞，是必要的。肾母细胞肿瘤1（WT1）是一种含有锌指并牵涉到肾发生与足细胞分化的转录因子。人[7-8]类WT1基因定位于染色体带11p13。包含10个外显子，跨度约50kb。肾发生的开始在未诱导的后肾间充质细胞可以检测到WT1基因的表达，在发展中胚其表达仍然偏低，通过进一步的分化，WT1基因表达下调，但在成熟肾小球的足细胞，表达保持到成年。有一些报告指出WT1-C末端多克隆抗体（WT1-C），只[9-11]表达在足细胞的细胞核，而肾小球系膜细胞和内皮细胞的细胞核不表达。因此我们选择WT1基因作为我们深入研究的靶点，为临床上更好的治疗DN提供理论依据。目前对于DN的治疗以控制血糖、血压，减少尿蛋白的排泄，改善脂代谢紊乱，保护肾功能等对症治疗为主，首选的药物为ACEI或ARB类，众多循证医学证据均证实此类药物作用于DN发病的多个环节，长期、大量应用能有效降低尿[12-14]蛋白。针对DN的复杂作用机制，我们应用中药的多靶点治疗作用以及中医学“治病求本”的治疗精髓，必然会找到一种行之有效的治疗方法。DN据其临6 前言床表现及病机特点，把其归纳到“消渴”、“水肿”、“腰痛”、“虚劳”、“尿浊”、“肾消”、“关格”等范畴。中医学认为本病的基本病因为先天禀赋不足，后天饮食不节，劳欲太过及情志失调，而其基本病机为本虚标实。大多数医家都认为DN的基本病机为气阴两虚，在疾病的发展过程中可伴有血瘀、痰浊（湿）、湿（痰）热等。而我们通过临床应用益气养阴活血方治疗DN，初步证实该方有降低患者临床期蛋白尿，延缓DN进展的作用。本课题研究的目的在于通过动物实验验证益气养阴活血方对DN大鼠肾组织WTI表达的影响，探讨中药制剂益气养阴活血方延缓DN肾损害的作用机理，为临床治疗DN提供理论依据，同时也为DN的研究提供更多的视角。7 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究材料与方法1实验材料1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠60只，体重200±20g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2010-0002。1.2实验药物益气养阴活血方中药颗粒：生黄芪、生地、菟丝子、积雪草、炙大黄、水蛭等颗粒药材购于河南中医学院第一附属医院中药房；低、高剂量组用药量分别为成人（按体重60kg计算）剂量的6.25倍（11.15g/Kg）、12.5倍（22.30g/Kg），充分溶解后灌胃给药。缬沙坦（代文）胶囊：由北京诺华制药公司提供，规格80mg，批号为：国药准字H20040217，用蒸馏水配制成1mg/ml的悬浊液，以8.33mg/Kg灌胃。生理盐水：由石家庄四药有限公司提供，批号为121025504。1.3主要试剂BUN、Scr、ALB、ALT、TG、CHO、GLU、24h尿蛋白定量等测定试剂盒，河南中医学院第一附属医院医院检验科提供。链脲佐菌素(STZ)：Sigma公司。柠檬酸(FW：210.14)：Sigma公司。柠檬酸钠(FW：294.10)：Sigma公司。Tris：北京鼎国生物技术发展中心。兔抗大鼠WT1一抗：SantCruz公司生物素标记山羊抗兔IgG：中杉金桥生物有限公司。DAB显色剂：中杉金桥生物有限公司。生理盐水(氯化钠)：天津化工厂。多聚赖氨酸：福州迈新生物技术有限公司。水合氯醛：青岛宇龙海藻有限公司。中性树胶：中国上海化学品有限公司。高效切片石蜡：上海华灵康复器械厂。盐酸：郑州派尼化学试剂厂。甲醛、乙醇、无水乙醇、二甲苯等购自于天津市化学试剂三厂。1.4常用试剂的配制8 材料与方法1.4.1PBS(磷酸盐缓冲液，PH7.4)：Nacl8gKcl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24gHcl1N蒸馏水定容至1000ml1.4.24%多聚甲醛磷酸缓冲液：多聚甲醛40gPH7.4PBS液1000mlNaOH1N1.4.3TBS(Tris缓冲盐溶液，PH7.6)Tris12.1gNacl17.5g浓Hcl7ml双蒸水定容至2000ml1.4.4DAB显色液：A液(DAB浓缩液)5μlB液(0.05mol/LTB)5μlC液(30%过氧化氢)5μl双蒸水150μl1.4.51％过碘酸水溶液0.5％过碘酸0.5g蒸馏水定容至100ml1.4.60.5％偏重亚硫酸钠液偏重亚硫酸钠0.5g蒸馏水定容至100ml1.4.7无色品红液(Schiff试剂)碱性品红0.25g蒸馏水50ml1N盐酸5ml偏重亚硫酸钠0.25g活性炭0.3g1.4.8苏木素染液9 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究苏木素0.9g氯化汞0.5g硫酸铝钾20g纯酒精10ml甘油10ml蒸馏水200ml1.4.9伊红染液伊红1g蒸馏水定容至100ml1.4.101N盐酸溶液浓盐酸(HCL)8.5ml蒸馏水91.5ml1.4.11多聚赖氨酸(PLL)多聚赖氨酸5g蒸馏水1000ml1.5主要仪器设备实验动物笼具(饲养笼、代谢笼)：由河南中医学院动物实验中心提供。各种手术器械：由河南中医学院动物实验中心提供。血糖分析仪及试纸：瑞特血糖仪及试纸。电子天平：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：PB4002-S。轮转式石蜡切片机：德国Leica,型号：RM2245。组织自动包埋机：德国Leica，型号：EG1150N。恒温摊片烤片机：湖北泰维医疗科技公司产品，型号：TK-218V。Olympus光学显微镜：日本产，型号：C-3020ZOOM。免疫荧光显微镜：德国Leica,型号：DM5500。图像分析系统：LeicaQwinPlus。漩涡混匀器：德国IKA，型号：Gonivs3。电热恒温培养箱：上海青宏，型号：DNP-9272。微量震荡仪：江苏姜堰市天力医疗器械有限公司，型号：TL-2000NMI。Hyc-1360冰箱(-20℃)：中国海尔电器公司。BCD-243141冰箱(4℃)：中国新飞电器公司。JA2003电子天平：天津宏洲建筑工程试验仪器有限公司。TS-1水平脱色摇床：金坛市杰瑞尔电器有限公司。万用电炉：北京中兴伟业仪器有限公司，型号：DL-1。10 材料与方法顺发牌不锈钢压力锅：迈新产品，编号：HPC-1001加样器、枪头：产地为吉尔森。2实验方法2.1实验动物分组与造模选用清洁级雄性SD大鼠（200±20g）60只，适应性喂养1周，随机分为5组：空白对照组（空白组）、模型对照组（模型组）、代文组、代文+中药低剂量组（低剂量组）和代文+中药高剂量组（高剂量组），各组大鼠过夜禁食不禁水12小时，称重后造模各组给予链脲佐菌素（STZ）45mg/kg（购自美国Sigma公司，溶于0.1mol/L新鲜配制的柠檬酸钠缓冲液中，pH4.5），空白组给予同等剂量新鲜配制的柠檬酸钠缓冲液单次腹腔注射，STZ注射后3天连续监测血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖阳性，尿蛋白阳性，尿量大于正常组150%者为造模成功，共40只大鼠成模，死亡8只。实验期间各组大鼠自由进食、饮水。2.2给药剂量空白组和模型组：灌服生理盐水，1ml/100g，每日1次。代文组：按每日80mg/Kg作为临床的常用剂量（成人体重按60Kg），计算出大鼠灌服代文剂量约为1.67mg/200g•d，使用时用蒸馏水配制成1mg/ml的混悬溶液。中药低剂量组：为成人常用剂量的6.25倍（成人体重按60Kg），计算出大鼠灌服中药量约为2.23g/200g•d，中药颗粒剂配制成1g/ml的溶液。中药高剂量组：为低剂量的2倍用量，计算出大鼠灌服中药量约为4.46g/200g•d，中药颗粒剂配制成2g/ml的溶液。高、低剂量组所用的代文量仍是1.67mg/200g•d。实验期间每周称重1次，及时调整给药量。2.3标本的采集大鼠造模成功后灌胃第6周末，用代谢笼收集24h尿，量取24h尿量，送河南中医学院第一附属医院检测24h尿蛋白定量；留尿后腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉，腹主动脉取血5ml，送河南省中医医院第一附属医院检测各项生化指标。切取右侧肾脏，去掉被膜，用生理盐水灌洗以除去肾脏血管内血液，用滤纸干燥，之后迅速称取重量；摘取左侧肾脏，去掉被膜，立即置于4%多聚甲醛固定，留作常规病理学观察及免疫组织化学观察。最后将动物全部折颈处死。2.4血生化指标检测每个样本取2ml血清和2ml尿液用AU800全自动生化分析仪检测FBG、BUN、Scr、ALT、ALB、TC、TG和24小时尿蛋白定量。2.5肾组织病理组织学观察—苏木素伊红(HematoxylinandEosin，HE)染色①固定：肾组织用生理盐水冲洗干净，除去包膜，投入4％多聚甲醛中固定；11 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究②脱水：用脱水盒将固定好的标本置于梯度酒精浸泡脱水；③透明：二甲苯(I)、(Ⅱ)各浸泡10min；④浸蜡：50～60℃浸蜡2h；⑤修块、切片、捞片：蜡块放冷至成硬块，修整成长方形，冷冻一段时间后，取出用切片机切成4µm厚薄片，漂浮在水面上，以载玻片捞起，按实验分组编号，烤片(60℃，2h)；⑥切片脱腊至水化：二甲苯I中10min，二甲苯II中10min，无水乙醇I3min，无水乙醇II3min，95％乙醇I3min，95％乙醇II3min，80％乙醇1min，自来水洗1min；⑦HE染色：苏木素染色5min，自来水冲洗；1％盐酸酒精分化lmin，自来水洗10min；伊红染色3min；⑧脱水、透明、封固：80％乙醇1min，95％乙醇I2min，95％乙醇II2min，无水乙醇I3min，无水乙醇II3min，二甲苯I中5min，二甲苯II4min，二甲苯III中3min，以中性树胶封固。⑨光镜观察及照相取片：制作完毕的切片，在显微镜下观察、拍照。2.6肾组织病理组织学观察-PAS染色(过碘酸-雪夫氏染色)(1)石蜡切片，常规脱蜡至水；(2)1％过碘酸水溶液氧化10min，蒸馏水充分洗；(3)Schiff试剂染色10min，流水冲洗10min；(4)苏木素淡染细胞核，充分流水洗；(5)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；(6)免疫荧光显微镜下分析研究并拍照。2.7肾组织中WT1表达变化--免疫组化(IHC)法(1)石蜡切片，常规脱蜡至水；(2)抗原修复：PH8.0∕9.0Tris-EDTA抗原修复；(3)3﹪H2O2去离子水孵育10min，PBS缓冲液冲洗各5min×2次；(4)滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)，室温孵育15min，倾去，勿洗；(5)分别滴加按1:100稀释好的一抗，37℃孵育3小时；(6)PBS缓冲液冲洗各5min×2次，脱色摇床5min×2次；(7)滴加试剂B(生物素标记山羊抗兔IgG工作液)，放入电热恒温培养箱孵育20min；(8)PBS缓冲液冲洗各5min×2次，脱色摇床5min×2次；(9)滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，37℃孵育20min；(10)PBS缓冲液冲洗各5min×2次，脱色摇床5min×2次；(11)DAB显色：滴加DAB—H202显色液(预先5分钟配制)，显微镜下控制染色时12 材料与方法间，自来水浸洗终止反应。(12)复染，脱水，透明，封片。(13)免疫荧光显微镜下分析研究并拍照。3统计学处理采用SPSSVersion13.0forWindows进行数据统计，以均数±标准差(xs)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，统计显著性水平为P<0.05或P<0.01，有统计学意义。13 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究结果1.1实验大鼠的一般情况空白组大鼠无糖尿病多饮、多食、多尿等症状，眼睛有神，皮毛有光泽，肌肉丰满，反应灵敏，粪便呈麦粒状。其余4组注射STZ后，出现明显的多饮、多食、多尿症状，并慢慢出现消瘦、精神萎靡、反应迟钝、皮毛无光泽、少动抱团、弓背竖毛。实验将近结束时，造模各组大鼠体重明显下降，骨骼突出，肌肉偏少，以模型组最为明显。实验结束时空白组11只、模型组10只、高剂量组8只、低剂量组8只、代文组9只。1.2各组大鼠体重、肾重、肥大指数（肾重/体重）的比较用药治疗6周后，空白组、模型组、代文组、高剂量组、低剂量组大鼠体重差别明显；而各组大鼠肾重无显著性差异。肥大指数的比较如下：空白组与各造模组存在显著性差异（P<0.01），模型组与代文组有明显差异（P<0.05），模型组与高、低剂量组存在显著性差异（P<0.01）；代文组与高、低剂量组存在显著性差异（P<0.01）；高、低剂量组有差异（P<0.01）。如表1、图1所示。表1各组大鼠肾脏肥大指数比较（xs）组别n体重（g）肾重（g）肥大指数（‰）空白组11430.96±83.311.3110±0.20463.09±0.39Δ◆模型组10236.47±17.271.4210±0.16036.02±0.61Δ◆代文组9248.27±16.331.3764±0.06795.56±0.35Δ▲◇●低剂量组8299.51±19.761.3767±0.06614.61±0.39Δ▲◇高剂量组8309.48±34.581.2137±0.17863.92±0.35Δ◆▲注：肥大指数：与空白组相比，P<0.01；与模型组相比，P<0.05，P<0.01；与代文组相◇●比，P<0.01；与高剂量组相比，P<0.01。14 结果1.3大鼠空腹血糖（FBG）的变化空白组与模型组、代文组、高剂量组、低剂量组比较，有显著性差异（P<0.01）；模型组与代文组比较有差异（P<0.05），与高剂量组、低剂量组相比，有显著性差异（P<0.01）；代文组与高、低剂量组比较，有显著性差异（P<0.01）；高、低剂量比较无显著性差异（P>0.05）。如表2、图2所示。表2大鼠空腹血糖（FBG）的变化（xs）组别nFBG（mmol/L）空白组119.33±2.91Δ◆模型组1028.56±0.81Δ◆代文组927.05±0.97Δ▲◇●低剂量组819.85±1.48Δ▲◇高剂量组819.85±1.03Δ◆▲注：与空白组相比，P<0.01；与模型组相比，P<0.05，P<0.01；与代文组相比，◇●P<0.01；与高剂量组相比，P>0.05。15 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究1.4大鼠肝、肾功能的变化在实验结束时空白组大鼠的ALB、ALT、BUN、Scr基本维持在正常范围内。空白组的ALB与代文组、高剂量组、低剂量组、模型组相比，有显著性意义（P<0.01）；模型组与代文组比较有差异（P<0.05），与高剂量组、低剂量组比较有显著性差异（P<0.01）；代文组与高、低剂量组相比有显著性差异（P<0.01）；高、低剂量比较无显著性差异（P>0.05）。关于ALT、BUN、Scr，空白组与模型组、高剂量组、低剂量组、代文组相比，总体无显著性差异（P>0.05）。如表3、图3所示。表3大鼠肝、肾功能的变化（xs）组别nALBALTScrBUN空白组1124.10±1.7587.36±16.4341.79±4.808.87±0.97Δ◆模型组1016.99±0.69105.10±29.2443.91±10.8110.24±1.88Δ◆代文组918.28±0.9086.00±31.6242.18±11.0010.46±3.24Δ▲低剂量组820.81±0.99103.38±35.4738.86±7.419.28±2.97Δ▲高剂量组821.80±1.1685.00±30.9339.46±3.988.28±2.66Δ◆▲注：ALB：与空白组相比，P<0.01；与模型组相比，P<0.05，P<0.01；与代文组相比，◇●P<0.01；与高剂量组相比，P>0.05。16 结果1.5大鼠血脂的变化空白组TC与代文组、低剂量组、模型组比较，具有显著性差异（P<0.01），与高剂量组比较有差异（P<0.05）；模型组与高剂量组、低剂量组相比具有显著性差异（P<0.01），与代文组比较无显著性差异（P>0.05）；代文组与低剂量组比较有差异（P<0.05），与高剂量组相比，具有显著性差异（P<0.01）；高剂量组与低剂量组相比，有显著性差异（P<0.05）。空白组TG与代文组、模型组比较具有显著性差异（P<0.01），与高、低剂量组比较无显著性差异（P>0.05）；模型组与代文组比较无显著性意义（P>0.05），与低剂量组比较有意义（P<0.01），与高剂量组比较有显著性差异（P<0.01）；代文组与高、低剂量组相比，有显著性差异（P<0.01）；高剂量组与低剂量组比较无显著性差异（P>0.05）。如表4、图4所示。17 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究表4大鼠血脂的变化（xs）组别nTCTG空白组111.39±0.261.12±0.38ΔΔ模型组102.09±0.223.60±0.68Δ◆Δ◆代文组92.08±0.203.32±0.37Δ◇▲◇*低剂量组81.84±0.101.64±0.44▲*▲◇高剂量组81.62±0.091.35±0.14Δ▲◆◇注：TC：与空白组相比，P<0.01，P>0.05；与模型组相比，P>0.05，P<0.01；与代文◇*◇组相比，P<0.05，P<0.01；与高剂量组相比，P<0.05。TG：Δ▲◆◇与空白组相比，P<0.01，P<0.05；与模型组相比，P>0.05，P<0.01；与代文组相◇*比，P<0.01；与高剂量组相比，P<0.05。1.6大鼠24小时尿蛋白定量的变化空白组24小时尿蛋白与代文组、低剂量组、模型组比较具有显著性差异（P<0.01），与高剂量组比较无显著性差异（P>0.05）；模型组与代文组、低剂量组比较有差异（P<0.01），与高剂量组比较有显著性差异（P<0.01）；代文组与高剂量组相比，有差异（P<0.01），与低剂量组比较无显著性差异（P>0.05）；高剂18 结果量组与低剂量组比较有差异（P<0.01）。如表5、图5所示。表5各组大鼠24h尿量及尿蛋白的比较（xs）组别n24h尿量24h尿蛋白空白组1113.09±2.740.0371±0.0166Δ模型组1041.80±5.010.1818±0.0372Δ◇代文组942.89±6.580.0834±0.0167Δ◇◆低剂量组841.50±3.550.0802±0.0121▲◇*高剂量组843.38±6.160.0553±0.0075Δ▲◇◆注：与空白组相比，P<0.01，P>0.05；与模型组相比，P<0.01；与代文组相比，P>0.05，*◆P<0.01；与高剂量组相比，P<0.05。1.7大鼠的肾脏外观及病理变化空白组大鼠：肉眼察看肾脏大小、症状正常，色暗红，表面光滑，包膜易剥离、无粘连。光镜下肾小球结构清晰、完整，未见肥大，肾小球毛细血管基底膜、系膜及其基质未见异常改变。模型组大鼠：肉眼查看肾脏体积增大。光镜下可见肾小球弥漫性肥大，肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚、僵直，系膜区增宽，系膜细胞增生，系膜基质增多，部分足细胞、壁层上皮细胞肥大、少数脱落。代文组、19 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究高剂量组与低剂量组也均有不同程度的病理改变，但与模型组相比病变相对较轻。1.8大鼠肾组织中WT1蛋白表达的情况大鼠肾组织中WT1的表达仅见于肾小球，在肾小球脏层上皮细胞表达，肾小管内无表达。每样本观察10个肾小球，分别计算WT1阳性表达细胞核数，取其平均数作为该样本WT1阳性表达指数。免疫组化结果显示：与空白组比较造模组WT1的表达明显减少，具有显著性差异（P<0.01）；造模组中模型组WT1的表达最少，与代文组、高剂量组、低剂量组的差异有显著性意义（P<0.01）；WT1在代文组与高剂量组、低剂量组的差异有显著性意义（P<0.01）；高剂量组、低剂量组中WT1的表达无显著性意义（P>0.05）。如表6、图6所示。表6各组大鼠肾组织中WT1蛋白表达的比较（xs）组别n肾小球体积WT1蛋白表达空白组11101.58±9.9115.81±1.21Δ模型组10186.93±16.198.14±0.87Δ◇代文组9129.86±8.2110.96±0.92Δ◇◆▲低剂量组8156.57±7.1613.14±0.45Δ◇◆高剂量组8132.86±7.3213.46±0.92Δ◇◆注：与空白组相比，P<0.01；与模型组相比，P<0.01；与代文组相比，P<0.01；与高剂▲量组相比，P<0.05。20 讨论讨论DN是DM常见的微血管并发症之一，是DM致死的主要原因之一，也是导致ESRD的主要独立因素。目前随着我国经济的发展和国民平均寿命的延长，DM的患病率在持续增加，DN的患病率约占1型糖尿病的33%-40%，约占2型糖尿［15］病的20%-25%。一旦进入临床DN，肾脏损害发展非常快，若再加上治疗不及时，很快进入ESRD。因此及早发现、诊断和治疗，才有可能延缓和控制该病的进展。DN发病机制复杂，蛋白尿是DN的主要临床特点，同时也是DN进程的能动因子。蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障结构的破坏及功能的损伤关系密切。足细胞和足细胞伸出的足突及足突和足突之间的裂孔膜是肾小球滤过屏障的最外层。而且近来，越来越多的证据表明足细胞是DN蛋白尿形成和发展的重要参与者。日本的学者在尿液中发现了足细胞，在此基础上进一步研究发现53％的2型糖尿[16]病患者有微量白蛋白尿，80％的2型糖尿病患者有大量白蛋白尿。在此研究中通过对研究足细胞数量来观察足细胞的损伤，然而因为足细胞和肾小球结构的复杂性，在现行的条件下用光学显微镜来测量足细胞的数量是非常困难的，不适用于临床研究。因此，发现一种方便的标记，来研究肾脏疾病患者的足细胞，是必要的。DN的治疗，目前仍以控制血糖、血压，改善脂代谢紊乱，减少尿蛋白，保护肾功能，治疗并发症等对症措施为主，然而总体上治疗效果不是十分理想。近年来中医药治疗DN取得了较好的疗效，特别是中西医结合治疗显示出其独特的优势。1.中医对DN的认识中医古典医籍中无糖尿病肾病一名，但据其临床表现及病机特点，可归纳到“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“虚劳”、“关格”等范畴。如《素问·奇病论》曰：“„„。肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”。又如«圣济总录»记载:“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，水液聚于体内而出现水肿。”再如《伤寒论·平脉法》记载的“关则不得小便，格则吐逆”。近代医家吕仁和教授提出了把糖尿病肾病的中医病名定为“消渴病肾病”，得到了众多医家的认同。因为这一提法既强调了该病继发于消渴病，又强调了其中心病位在肾，治疗当以护肾为主。中医学认为本病的基本病因为先天禀赋不足，后天饮食不节、劳欲太过和情21 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究志失调。基本病机为本虚标实。大多数医家都认为DN的基本病机为本虚标实，在疾病的发展过程中可伴有血瘀、痰浊（湿）、湿（痰）热等，虚实夹杂，互相影［17］响，共同加重疾病病情。如邹丽华等认为糖尿病肾病的病机特点为脾胃（或肝）气阴两虚夹血瘀。吕仁和等认为糖尿病肾病的病机特点为气阴两虚，但气阴两虚可向肝肾阴虚、脾肾阳虚、阴阳两虚转化，同时可兼痰湿、湿热、瘀血。杨［18］霓芝认为本病临床多见气阴两虚之证.目前中医在DN的治疗上多选用益气养阴活血化瘀类药物。本课题选用的益气养阴活血方是导师宋纯东教授结合多年的临床实践经验，依据中医“久病必虚”、“久病必瘀”、“久病入络”的理论，认为本虚标实、肾虚络瘀是本病的基本病机特点。在治疗上依据“急则治其标缓则治其本”“上工治未病”“标本兼治”的治疗原则，结合自己多年临床经验拟定的以益气养阴、活血化瘀为主的方剂，方药由生黄芪、生地、菟丝子、积雪草、炙大黄、水蛭组成。现代多项研究发现，黄芪对肾小管具有明确的保护作用，能明显降低DN大鼠血糖及糖化血红蛋白，减少尿白蛋白；积雪草提取物具有抗炎及抑制成纤维细胞增殖的作用；大黄能够延缓DN病变肾单位的病程进展，减少蛋白尿，改善糖尿病患者的脂肪、糖、蛋白质代射的异常，并能对肾脏组织的糖基化产物的形成有抑制作用，从而保护肾脏；水蛭能够改善肾脏微循环，防止肾小球硬化，保护肾功能，减轻尿蛋白的排出。诸药成方，具有益气补肾、活血化瘀之效，寒温并用，补泻兼施，可使肾元得补，瘀浊得除，标本兼顾，而诸症自愈。2.糖尿病大鼠的造模方法和糖尿病肾病的形成糖尿病大鼠造模的方法很多，如：①化学药物法：应用化学药物如链脲佐菌素（STZ）、四氧嘧啶等特异性破坏胰岛β细胞；②胰腺切除法；③化学药物联合胰腺部分切除法；④自发性动物模型：db/db小鼠、NOD小鼠、KK小鼠、BB糖尿病大鼠、Zuckerfa/fa大鼠等；⑤转基因动物模型。其中以化学药物法中的注射STZ造模的方法应用最多。本实验对雄性SD大鼠单次腹腔注射STZ造模，注射3天后大鼠血糖升高≥16.7mmol/L，尿糖阳性，同时大鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降等糖尿病的典型表现时，即为糖尿病造模成功。［19］有研究表明，到目前为止，对DN肾组织病理变化的大部分研究多采用STZ诱导的动物模型。而且是探究糖尿病肾损害机制和治疗干预措施时非常重要的、广为接受的模型。STZ选择性地破坏胰岛β细胞，而后造成胰岛素分泌不足，［20］引起血糖升高，且对其他脏器作用很小，是目前制备DM动物模型常用的药物。给药后随着病程的进展，在高血糖的作用下大鼠肾脏发生损害，同时也符合DN病理形态学改变。对其他组织STZ有非特异性毒性，高剂量时（≥200mg/Kg）可22 讨论［21］［22］导致大鼠和小鼠出现急性肾损害。杨亦彬等研究回示糖尿病成模后2周大鼠的尿蛋白排泄即大于30mg/24h。现为了减轻STZ的非特异性毒性，多采用低剂量（40-55mg/Kg）注射诱导糖尿病。本研究在既往实验的基础上采用SD大鼠一次性腹腔注射STZ45mg/Kg，诱导糖尿病模型，注射3天后测鼠尾静脉血≥16.7mmol/L，尿糖阳性者纳入研究，DM成模后4周出现尿蛋白，即DN成模。3.糖尿病肾病的足细胞与蛋白尿近些年来糖尿病患病率迅速增加，特别是在发展中国家，DN日益增多。蛋白尿是DN的临床特点之一，既往研究认为DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚、肾小球硬化及肾间质纤维化。然而，这些因［23］素仅能解释30%-50%的尿蛋白排泄率和肾小球率过滤的变化。现越来越多的证据表明足细胞是DN蛋白尿的形成和发展的重要参与者。蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障结构的破坏及功能的损伤关系密切。肾小球滤过屏障由多孔的内皮细胞、网状结构的GBM和脏层上皮细胞足突间的裂孔隔膜(slitdiaphragm，SD)三［24］部分构成。内皮细胞功能异常与肾小球内血流动力学异常改变有关。GBM的增厚与IV型胶原的蓄积和结构成分发生变化有关。而足细胞和足细胞伸出的足突及足突和足突之间的裂孔膜是肾小球滤过屏障的最外层，也即最后“关卡”，所以足细胞丢失必然伴随大量蛋白尿。足细胞是维持肾小球滤过屏障结构及正常功能的主要细胞之一，它参与维持肾小球滤过屏障的功能，稳定肾小球毛细血管，调节超滤系数Kf，保持GBM的正常形态。糖尿病时存在的高血糖、高血压等多种因素可导致足细胞的脱落或凋亡，其通过活性氧基团、细胞因子及血流动力学的改变而起作用。GBM的裸露、足细胞数目的减少会导致肾小球组织形态学的一连串变化，进而引起尿蛋白，加速肾损害进程。但因足细胞和肾小球结构的复杂性，在现行的条件下用光学显微镜来测量足细胞的数量是非常困难的。WT1基因是一种含有锌指并牵涉到肾发生与足细胞分化的转录因子，由其编码的WT1表达在肾脏发育的各个阶段，然而出生后仅表达在足细胞核，参与维持足细胞的功能，是足细胞的特异性标志之一。有研究发现，在肾小球的三种细胞中，WT1只在足细胞核是阳性表达，在系膜细胞和内皮细胞胞核都是阴性表达。因而WT1可以作为足细胞胞核的标记。4.WT1和肾小球功能人体的肾脏包含大约1200000个肾单位。每个肾单位是由肾小球（过滤发生的地方）和近端、远端小管（过滤液体转换成尿液的地方）组成的。[25]肾小球主要包含三种类型的细胞：肾小球内皮细胞，肾小球系膜细胞和肾23 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究小球脏层上皮细胞，也称为足细胞，每一种都在维持正常肾小球的结构和功能上起着重要作用。在成人肾，WT1继续在足细胞中表达，这表明WT1在这些细胞的功能上的重要作用。为印证这一假说，有小鼠模型表明，WT1基因的破坏可导[26-28]致肾小球硬化的发展，这种疾病的特征是肾小球周围的细胞外基质的积累。然而，这种潜在的机制，仍有待进一步研究。足细胞在肾小球的血管内成线性分布。它们为肾小球簇提供结构支持，并且参与到维护肾小球的基底膜。WT1基因的破坏导致GBM的增厚早在肾功能衰竭的发展中，而这可能是WT1在正常肾小球功能起作用的一种方式。足细胞也参与在肾小球滤过率的调节。关于后者，足细胞的次级足突形成了肾小球毛细血管外侧相互交叉的模式。这些次足突被称为裂孔膜的超薄膜所分离。滤液依次通过内皮细胞窗孔，GBM和裂孔膜进入肾小囊。肾小球过滤孔的直径和糖基化蛋白质的电荷呈现阻止即使是最小的等离子体白蛋白（69KD）进入滤液。曾经假设足细胞可以改变裂孔膜的渗透性，通过足突上的基于微丝的收缩装置。大量的蛋白质参与到裂孔膈膜的运作，而这种基于微丝的收缩装置包括肾病蛋白[29][30][31][32][33]、CD2AP、podocin分子、细胞标志蛋白和α-辅肌动蛋白4。细胞标[34]志蛋白已证明是WT1的靶基因，并有一些证据证明，肾病蛋白的表达也受WT1[35]基因的调节。糖尿病肾病的蛋白尿也应受WT1基因的调节。WT1是足细胞的标记蛋白，而当足细胞大量丢失，数目减少时，会产生大量蛋白尿，那么WT1的蛋白表达与蛋白尿的丢失也应是负性相关关系。SrichaiMB等的研究也证实了这一观点。在本实验中我们观察了益气养阴活血方对WT1在糖尿病肾病大鼠模型表达的影响，而切入点就是蛋白尿，通过中药对实验前后大鼠蛋白尿的干预，推测了益气养阴活血方对WT1蛋白表达的间接作用，并通过免疫组化来进一步验证。对照西药采用了ARB类的代文，ARB对蛋白尿的治疗作用已得到了循证医学的证实。实验结果回示：实验结束时与模型组比较，代文组、高剂量组、低剂量组的尿蛋白明显降低，具有显著差异（P<0.01），高剂量组和低剂量组的尿蛋白与代文组相比，低剂量组无显著差异（P>0.05），高剂量组有差异（P<0.01），高、低剂量相比，高剂量效果更明显（P<0.01）；WT1的表达，代文组、高剂量组、低剂量组与模型组相比，具有显著意义（P<0.01），高、低剂量组较代文组，具有显著意义（P<0.01），高、低剂量组之间，无显著性差异（P<0.05）。在我们的实验中我们可以看到，WT1蛋白的表达与尿蛋白成负性相关关系，［36］但也有研究通过大鼠阿霉素肾病模型观察到,在模型组的2、4、6、8周，随着大鼠24h尿蛋白量的增多，肾脏病理的加重，WT1蛋白的表达呈进行性上升的趋势。该研究表明足细胞损伤时的第一时间内，也许WT1的蛋白表达是上升的，这24 讨论可能是启动自身的代偿机制所致。但这种表达也许会更严重地破坏足细胞分子之间的平衡调节状态，但这种调节过程还需要我们用更严密的实验研究证实。5.结果与分析5.1益气养阴活血方对肾组织病理形态学的影响DN出现最早、最明显的肾脏病理变化为肾脏肥大，也是导致肾小球硬化的重要因素。而衡量肾脏肥大的客观指标是肾重/体重指数，它可以在排除体重影响的情况下对肾重进行观察。本实验研究结果回示，实验结束时，各造模组的肾重/体重指数较空白组明显增加，说明造模组大鼠肾脏肥大，符合DN早期的病理变化。高、低剂量组的肾脏肥大指数明显低于模型组（P<0.01），比代文组稍好，说明益气养阴活血方可以有效抑制肾脏肥大，改善肾脏病理变化。5.2益气养阴活血方对血糖的影响高血糖可以诱发肾病，进而诱导各种细胞介质、血管活性物质、生长因子、[37]化学趋化生长因子等的综合作用，加速肾脏的损害。本研究结果回示，益气养阴活血方治疗6周后，DN大鼠血糖水平较模型组显著降低（P<0.01），表明益气养阴活血方可以降低血糖，改善高血糖所致的肾脏损害。5.3益气养阴活血方对血脂的影响DN是内分泌代谢疾病DM的并发症，本身就有血脂、血糖代谢紊乱的情况存在。脂代谢紊乱不仅可以提高心脑血管病的发病率，还可以诱导血小板聚集、释放，诱导单核-巨噬细胞浸润并释放细胞因子和多种水解酶，生成氧自由基等多方面的机制来损害肾小球的结构和功能。本实验研究结果回示DN大鼠存在着脂代谢异常的情况，表现为造模组的TC和TG较空白组明显增高，用益气养阴活血方中药治疗后，TC、TG水平明显下降，表明该方可以改善脂代谢紊乱，从而减少肾小球的损伤，起到保护肾脏的作用。5.4益气养阴活血方对肾功能的影响本实验结果回示，益气养阴活血方治疗6周后，大鼠Scr、BUN较模型组明显降低，与代文组比较，效果较理想，但总体差异不大。总的来讲，益气养阴活血方对改善肾功能的效果明显。6.思考与展望本实验通过单次腹腔注射STZ的方法建立1型DM大鼠模型，后通过持续高血糖状态对肾脏的影响，造成DN大鼠模型。后通过给予不同的药物治疗，同时观察24h尿蛋白定量、血浆白蛋白、谷丙转氨酶、血尿素氮、血肌酐、血脂、血糖等生化指标来观察不同药物对DN的治疗效果，为临床治疗DN提供一定的25 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究实验依据。并通过免疫组化方法检测肾组织中WT1的表达情况，间接反映出足细胞的损伤情况及临床尿蛋白的流失情况，同时也验证了益气养阴活血方对改善DN肾组织病理的疗效。但本实验也有很多不足之处，如有研究通过观察尿中WT1的表达情况表明，在DN的早期，甚至在蛋白尿出现之前WT1的表达就已经出现，而我们的实验选择以蛋白尿为切入点来研究DN的早期变化，并围绕着蛋白尿的产生机制来选择WT1作为我们的研究目标，这在表面上看是合理的，但如果仔细推敲也会有很多问题。如既然有实验表明WT1是在蛋白尿产生之前出现的，那是否可以通过早期对WT1的研究来阐释蛋白尿，甚至通过某种干预措施来阻断蛋白尿的产生，为DN的临床治疗从源头提供一种新的思路，这也需要更多的学者用更好的思路、更精密的实验来进行尝试和实践。26 结论结论1.益气养阴活血方可以减少DN大鼠的尿蛋白，减轻DN大鼠的肾脏病理损害。同时为临床治疗DN提供了一种依据。2.益气养阴活血方能够影响肾组织中WT1的表达。27 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究参考文献[1]M.E.Molitch,R.A.DeFronzo,M.J.Franz,W.F.Keane,C.E.Mogensen,H.H.Parving,etal.,Nephropathyindiabetes.AmericanDiabetesAssociation,DiabetesCare27(Suppl.1)(2004)S79–S83.[2]R.M.Mason,N.A.Wahab,Extracellularmatrixmetabolismindiabeticnephropathy,J.Am.Soc.Nephrol.14(2003)1358–1373.[3]B.S.Weston,N.A.Wahab,R.M.Mason,CTGFmediatesTGFbinducedfibronectinmatrixdepositionbyupregulatingactivea5b1integrininhumanmesangialcells,J.Am.Soc.Nephrol.14(2003)601–610.[4]R.E.Gilbert,H.Krum,J.Wilkinson-Berka,D.J.Kelly,Thereninangiotensinsystemandthelong-termcomplicationsofdiabetes:pathophysiologicalandtherapeuticconsiderations,Diabet.Med.20(2003)607–621[5]M.W.Steffes,D.Schmidt,R.McCrery,J.M.Basgen,Glomerularcellnumberinnormalsubjectsandintype1diabeticpatients,KidneyInt.59(2001)2104–2113.[6]T.Nakamura,C.Ushiyama,S.Suzuki,M.Hara,N.Shimada,I.Ebihara,etal.,Urinaryexcretionofpodocytesinpatientswithdiabeticnephropathy,Nephrol.Dial.Transpl.15(2000)1379–1383.[7]CallKM,GlaserT,ItoCY,BucklerAJ,PelletierJ,HaberDA,etal.Isolationandcharacterizationofazincfingerpolypeptidegeneatthehumanchromosome11Wilms’tumorlocus.Cell1990;60:509–20.[8]GesslerM,PoustkaA,CaveneeW,NeveRL,OrkinSH,BrunsGAP.HomozygousdeletioninWilms’tumorsofazinc-fingergeneidentifiedbychromosomejumping.Nature1990;343:774–8.[9]Y.X.Yang,M.C.Gubler,H.Beaufils,DysregulationofpodocytephenotypeinidiopathiccollapsingglomerulopathyandHIV-associatednephropathy,Nephron91(2002)416–423.[10]A.L.Menke,A.IJpenberg,S.Fleming,A.Ross,C.N.Medine,C.E.Patek,etal.,Thewt1-heterozygousmouse;amodeltostudythedevelopmentofglomerularsclerosis,J.Pathol.200(2003)667–674.[11]Y.X.Yang,C.Jeanpierre,G.R.Dressler,M.Lacoste,P.Niaudet,M.C.Gubler,WT1andPAX-2podocyteexpressioninDenys–Drashsyndromeandisolateddiffusemesangialsclerosis,Am.J.Pathol.154(1999)181–192.[12]FriedLF,DuckworthW,ZhangJH,etal.DesignofcombinationangiotensinreceptorBlockerandangiotensinconvertingenzymeinhibitorfortreatmentofdiabeticnephropathy（VANEP-28 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致谢致谢首先向导师宋纯东教授致以衷心的感谢和崇高的敬意！三年来，导师无论是在工作上还是学习上，都给予了我很很多的帮助。他的学识、医德、治学态度、作作风使我终身受益。这对我以后的工作、学习产生了很大的影响。感谢父母及家人给予我的支持，没有你们就没有我的今天。本课题的设计研究、实施完成均得到了张翥、卢跃卿、张琳琪主任们的关心、支持和帮助，在此表示深深的谢意!课题研究过程中，得到了河南中医学院第一附属医院儿科实验室杨晓青、李金刚老师的指导和帮助！得到了肾病科全体医护人员的帮助和支持，谨此致以诚挚的谢意！在研究生三年的学习中，我的学习和临床知识得到了进一步的提高。临床实习过程中，不但教会了怎么去工作、学习，还教会了我做人的道理。感谢肾内科邢海晏、李瑞娟、喻青、王峥、马继伟、彭贵军、王瑞莉、张丽君等肾内科全体医护人员的指导和帮助。感谢薛黎明师姐、杨晓丽师姐、任瑞英师姐、侯晓静师姐、吴晨晨师妹、张绿凤师妹、秦林芳师妹的无私帮助！衷心感谢审阅本论文的专家教授，感谢答辩委员会的各位老师和专家们对我的论文提出的宝贵建议，为我今后的学习和研究开拓了思路。谨此，也向本文引用过资料的国内外专家、教授、老师表示感谢！31 附录1病理照片附录1病理照片代文组（PAS×400）节段毛细血管袢扩张，偶低剂量组（PAS×400）毛细血管袢扩张、局灶见系膜节段轻度增生。节段系膜轻度增生。高剂量组（PAS×400）肾小球略显肥大，毛细空白组（PAS×400）肾小球结构清晰，未见肥血管袢扩张、偶见系膜节段轻度增生。大，肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常改变模型组（PAS×400）小球肥大，系膜细胞和基质轻度增生，GBM增厚、僵直，阶段扩张。33 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究WT1表达（×400）代文组（×400）足细胞核阳性表达低剂量组（×400）足细胞核阳性表达高剂量组（×400）足细胞核阳性表达，部分空白组（×400）足细胞核阳性表达小管细胞阳性表达模型组（×400）足细胞核阳性表达34 附录2文献综述附录2文献综述综述一糖尿病肾病的中医药研究糖尿病肾病也称为糖尿病性肾小球硬化症，是糖尿病微血管并发症的一种，发病率随着糖尿病病程延长而增高。早期无明显症状，随着病程的延长会出现微量蛋白尿、大量蛋白尿、水肿、高血压等等，直至发展为肾功能不全，目前已成为终末期肾功能衰竭需接受透析治疗的主要原因之一。糖尿病患者微量蛋白尿的出现，标志着早期肾病的出现，同时也增加了心脑血管疾病的患病率，需高度重视。目前西医的治疗以控制血糖、血压、改善脂代谢紊乱和抗凝等为主，尽管有效但也有一定的局限性，不能从根本上改变糖尿病肾病的病程。而中医药治疗糖尿病肾病取得了较好的疗效，特别是中西医结合治疗，在改善临床症状，提高患者生存质量，降低生化指标，保护肾功能等方面起到重要作用，并且显示出中医药治疗的独特优势。1.糖尿病肾病的中医病名中医无糖尿病肾病一名，但据其临床表现及病机特点，把其归纳到“消渴”、“水肿”、“腰痛”、“虚劳”、“尿浊”、“肾消”、“关格”等范畴。如«圣济总录»记载:“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，水液聚于体内而出现水肿。”其描述的即是消渴病日久伤及肾气，出现水肿的情况。又如«证治要诀»中记载：“三消久而小便不臭，反作甜气，在溺中滚涌，更有浮在溺面如猪脂，此精不禁，真元竭也。”较详细地描述了消渴病并发尿浊的临床表现。再如«伤寒论·平脉法»记载的“关则不得小便，格则吐逆”，即是指糖尿病肾病晚期甚至尿毒症阶段。［1］近代医家对糖尿病肾病的中医病名也有独到的见解。如吕仁和教授认为糖尿病肾病的中医病名定为“消渴病肾病”比较合理。因为这一提法既强调了该病［2］继发于消渴病，又强调了其中心病位在肾，治疗当以护肾为主。赵进喜在吕仁和教授论述的基础上，针对糖尿病肾病具体病情以及发病的不同时期，提出了“消渴病·尿浊”、“消渴病·水肿”、“消渴病·关格”等不同的称谓。这一提法将消渴病与消渴病肾病不同时期的临床症状结合在一起，但仍不能很好的概括、［3］［4］描述该病的病位、病机。任爱华与南征在支持吕仁和教授观点的前提下，提出了“消渴肾病”一名，他们认为“消渴”本是一完整的病名，无需再加一“病”字，同时也认为“消渴肾病”与“肾消”相似，这对于本病病名渊源的认识意义重大。随着糖尿病患病人数越来越多，糖尿病肾病的发病率也逐年增长，这也就迫35 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究切要求进一步提高和完善糖尿病肾病的理论，尽早确立和统一糖尿病肾病的中医病名。“消渴肾病”这一病名既概括了糖尿病肾病发生发展的全过程，也较好地阐明了进展过程中的纷繁复杂的证候，对于临床防治意义重大，而且体现了中医特色，概括精当，言简意赅，值得推广。2.糖尿病肾病的中医病因病机中医学认为本病的基本病因为先天禀赋不足，后天饮食不节、劳欲太过及情志失调，而本病的基本病机为本虚标实。本虚为阴阳虚、气血虚和五脏虚，标实为水湿、痰浊和瘀血。消渴日久，耗气伤阴，阴损及阳，脾肾俱虚，水湿潴留，血脉瘀阻，浊毒内停是本病的基本病理过程。但在疾病的不同发展阶段，病机侧重点各有不同。［5］曹和欣等认为，糖尿病肾病发病的早期以阴虚为本，久则耗气，导致气阴［6］［7］两虚；后期阴损及阳，阴阳两虚。林氏认为气阴两虚是糖尿病肾病之本，［8］瘀血阻络是其标，肾虚痰瘀贯穿始终。何泽等认为本病的病机关键是毒损肾络。［9］卞镝等认为本病的基本病机为本虚标实，本为脏腑虚损，以脾肾气阴亏虚为主；［3］标为无形之痰。任爱华等认为糖尿病肾病的基本病机是三焦心脾肾阳气不足，决渎无能。吕仁和等认为糖尿病肾病的病机特点为气阴两虚，但气阴两虚可向肝［10］肾阴虚、脾肾阳虚、阴阳两虚转化，同时可兼痰湿、湿热、瘀血。赵健认为［11］本病初期的临床表现以气阴两虚加瘀为主。刘洪陆等认为应从痰瘀论治本病。［12］邹丽华等认为糖尿病肾病的病机特点为脾胃（或肝）气阴两虚夹血瘀。任秦［13］敏等认为本病采用益气养阴活血利水法，疗效显著，故而倾向于气阴两虚证［14］［15］型。张庚良认为本病临床多见气阴两虚之证。陈以平认为糖尿病肾病的病机是阴津亏耗，肾阴不足，久则气阴两伤，阴损及阳，阴阳两虚。总之，大多数医家都认为糖尿病肾病的基本病机为气阴两虚，在疾病的发展过程中可伴有血瘀、痰浊（湿）、湿（痰）热等，虚实夹杂，互相影响，共同加重疾病病情。但在疾病的不同发展阶段，病机侧重点各有不同。3.糖尿病肾病的中医药治疗3.1糖尿病肾病的辨证论治辨证论治是中医临床治疗糖尿病肾病最普遍的方法之一，同时辨证论治也是中医理论的精髓。在长期临床实践中凸显出在糖尿病肾病防治中的优势，而且比较符合本病发生发展规律的辨证论治方案为：分期辨证和分型辨证。3.1.1分期辨证［16］吕仁和将本病分为3期：（1）早期：即肾功能正常期，病位在肝肾，病机为气阴两虚、经脉失畅，络脉瘀结；（2）中期：即肾功能失代偿期，病位在脾肾，病机表现为阴损及阳，脾肾阳虚；（3）晚期：即尿毒症期。病位在五脏，病机是36 附录2文献综述五脏虚衰，痰湿瘀浊内停。3.1.2分型辨证［14］张庚良将糖尿病肾病分为4型：（1）气阴两虚型：以益气养阴活血为治则；（2）心肾阳虚型：以益气养心，泻肺利水为治法；（3）脾肾阳虚型：以健脾温肾，利水活血为治法；（4）阴阳两虚型：以益气固肾，补阴阳为治法。邵朝弟［17］教授将本病分为3型：（1）气阴两虚型，方采用参芪地黄汤、生脉散合六味地黄汤；（2）脾肾阳虚型：方用济生肾气丸、实脾饮、真武汤加减；（3）阴阳两虚：方用金匮肾气丸、大补元煎。［18］另外还有部分医家将分期辨证和分型辨证结合在一起来论治。如戴京璋将本病分为早中晚三期，而每一期又分别有三个主证。早期主证为肝肾气阴虚证、脾肾气阳虚证、阴阳气虚证；中晚期主证为气血阴虚、浊毒内停证，气血阳虚、［19］浊毒内停证，气血阴阳俱虚、浊毒内停证。聂莉芳将糖尿病肾病分为早中晚3期，同时又根据各期所表现症状的不同，分为不同的证型，如早期为表现为肺胃热盛、气阴两伤；中期可表现为气虚水停、阳虚水停、阴虚水停、湿热内蕴、气滞水停、血瘀水停等；晚期可分为肺脾气虚证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、气阴两虚证等。3.2专方治疗［20］邹丽红等采用芪地益气养阴活血方（黄芪、生地、葛根、丹参、山药、益母草、茯苓、泽泻、川芎、大黄、生甘草）治疗III、IV期糖尿病肾病的临床观察回示：治疗前后血糖、尿素氮、肌酐、血液流变学及尿白蛋白排泄率等指标，［21］总有效率治疗组（89.6%）优于对照组（68.1%）。杨明丽等益肾汤（黄芪、党参、山药、茯苓、山茱萸、红花、桃仁、蝉蜕等）治疗糖尿病肾病265例，结果［22］回示：早期总有效率100%；中期总有效率89%；晚期总有效率84%。王文凤自拟肾康宁汤加减（黄芪、丹参、杜仲、菟丝子、茯苓、女贞子、枸杞、怀牛膝、旱莲草等）治疗早期糖尿病肾病30例，总疗程8周，结果回示显效9例，有效［23］18例，无效3例，总有效率90%。林溢涛等补阳还五汤治疗糖尿病肾病35例临床观察，总有效率治疗组为88.6%，对照组为73.3%，2组比较，差异有显著性意义（P<0.05）.3.3单位中药及其提取物的治疗［24］李娟采用复方血栓通胶囊合金水宝胶囊来治疗早期糖尿病肾病，治疗组疗效优于对照组，其FBG、TC、TG、UAER及全血粘度高切值、低切值及血［25］浆粘度较对照组又明显差异。李徽用葛根素治疗20例糖尿病肾病，治疗组24h尿总蛋白、尿白蛋白及血黏度（血浆黏度和全血比黏度）均明显下降。王红纲等［26］给糖尿病肾病患者家用大黄代饮茶，结果表明大黄对降低微白蛋白尿，改善37 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究［27］肾功能，纠正血脂代谢紊乱及血液流变学紊乱等均有显著疗效。刘克辉等用复方丹参制剂治疗老年糖尿病肾病，治疗后总有效率80%，对照组为63.3%。赵［28］洪军等用大黄治疗32例早期糖尿病肾病，治疗后治疗组血肌酐清除率降低，增大的肾脏体积缩小，尿蛋白排泄减少，与对照组及治疗前相比有显著性差异，表明大黄可以抑制肾小球系膜组织的增殖，减轻细胞因子对肾小球的作用，进而能够减轻肾小球硬化，延缓肾脏损伤的进程。4.展望中医药治病强调个体的整体性，遵循辨证论治，方药加减灵活，再加上中药毒副作用小，安全性高，故中医药在治疗糖尿病肾病，特别是在预防及阻止进一步发展方面有较明确的优势。但糖尿病肾病在病变过程中，证型多变，变证丛生，虽然目前研究较多，但公认的统一的辨证标准及治疗方药仍较缺乏，不利于中医药治疗糖尿病肾病标准化、规范化的推广。因此客观地评价中医药的疗效，挖掘中医药的治疗特色，进一步深入研究中医药治疗糖尿病肾病，对提高糖尿病肾病的整体防治水平有着重要意义。参考文献：[1]吕仁和.糖尿病及其并发症中西医诊治学[M].北京:人民卫生出版社.1997.328.[2]赵进喜,邓德强,李靖.糖尿病肾病相关中医病名考辨[J].南京中医药大学学报,1998,(4):60.[3]任爱华,阚方旭.糖尿病肾病三焦辨治[J].山东中医学报,2000,19(6):328.[4]南征.消渴肾病（糖尿病肾病）研究[M].长春:吉林科学出版社,2001.3.[5]曹和欣,何立群.糖肾宁对早期糖尿病肾病大鼠高过滤的影响[J].上海中医药杂志.2001,35(5):19-21.[6]林兰,倪青,董彦敏.糖尿病肾病中西医结合治疗的热点问题述评[J].医学研究通讯.2000,29(7):50-52.[7]林兰,郭力.糖微康对糖尿病肾病患者血液流变学的影响[J].中国中西医结合肾病杂志.2003,4(4):215-217.[8]何泽,南征.糖尿病肾病―毒损肾络‖中医病机假说探讨[J].医药世界.2006,9:11-12.[9]卞镝,李敬林,董天宝.从痰论治糖尿病肾病[J].辽宁中医杂志.2006,33(11):1404-1405.[10]赵健.益气养阴活血法治疗早期糖尿病肾病临床观察[J].实用中医内科杂志,2005,19(5):447-448.[11]刘洪陆,郭惠芳.从痰瘀论治临床期糖尿病肾病-附181例临床分析[J].国医论坛,1999,14(3):22-26.[12]邹丽华,易晓红,鄢红.中西医治疗糖尿病肾病38例临床观察[J].光明中医,2001,16(9):59.[13]任秦敏,刘丽宁,马居里.益气养阴活血利水法治疗糖尿病肾病56例[J].陕西中医学院学38 附录2文献综述报,2007,30(3):17-18.[14]张庚良.糖尿病肾病的辨证治疗[J].河北中医,2005,27(8):594-595.[15]张先闻.陈以平辨治糖尿病肾病经验擷要[J].上海中医药杂志,2008,42(6):6.[16]吴海运.吕仁和治糖尿病肾病经验[J].江西中医药,2001,32(2):16.[17]高鸣,胡江华,孙善红.邵朝弟教授治疗糖尿病肾病的经验[J].四川中医,2006,24(4):6.[18]戴京璋,吕仁和,赵进喜,等.糖尿病肾病中医论治[J].北京中医药大学学报,2002,25(5):65-66.[19]孙红颖.聂莉芳教授辨治糖尿病肾病经验[J].中国中西医结合肾病杂志,2009,10(5):380-381.[20]邹丽华,张建华,刘平夫.芪地益气养阴方治疗III、IV期糖尿病肾病的临床观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2006,26(11):1023-1026.[21]杨明丽,沈璐,路波.益肾汤治疗糖尿病肾病265例[J].陕西中医,2005,26(8):755-756.[22]王文凤.健脾益肾活血法治疗早期糖尿病肾病疗效观察[J].中国医药,2007,2(6):346-347.[23]林溢涛,谭嫚娜,张建池.补阳还五汤治疗糖尿病肾病35例疗效观察[J].新中医,2006,38(7):29-30.[24]李娟,潘洁玲.复方血栓通胶囊合金水宝胶囊治疗早期糖尿病肾病临床研究[J].新中医,2008,40(6):19-20.[25]李徽.葛根素治疗糖尿病肾病20例[J].辽宁中医杂志,2006,33(11):1457.[26]王红纲,赵振霄,刘丽秋,等.大黄对糖尿病肾病治疗作用的临床研究[J].北京中医药大学学报,1996,19(5):36-37.[27]刘克辉,刘青,王玲等.复方丹参制剂治疗老年糖尿病肾病的临床研究[J].中国老年学杂志,2006,26:1562-1563.[28]赵洪军,韩学忠,徐梅等.大黄治疗早期糖尿病肾病32例[J].中国中西医结合杂志,1996,16(7):429-430.39 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究综述二WT1与糖尿病肾病糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的慢性并发症，是糖尿病患者死亡的一个重要原因。在临床上，约30％至50％的1型糖尿病（DM）患者和5%至10％的［1］2型糖尿病患者伴有DN，约1/3的患者将发展终末期肾脏疾病（ESRD）。糖尿病肾病的机制是非常复杂的。蛋白尿是肾功能损害的一个标志，也是促进肾脏疾病发展的一个重要的因素。足细胞损伤在蛋白尿的形成和DN的持续进［2,3,4］展中起着重要的作用。Wilms肿瘤1（WT1）是一种锌指状的转录因子和足［5,6］细胞特异性标记。这对维持足细胞正常的功能是重要的。1WT1基因1.1WT1基因人类WT1基因定位于染色体带11p13（即11号染色体短臂1区3带），包含10个外显子，跨度约50kb。是由KnudsonA．GJr和StrongL．C在1972年调查研究58个家族性Wilms肿瘤史的家庭时发现并命名的。后在1990年，由Call等人克隆、分离鉴定出。WT1基因主要编码一个约3kb的转录本，但也有报道可以编码一些小的转录本。WT1转录翻译揭示的是一种蛋白质，它在羧基末端包含4个Kruppel类的锌指结构，而且有脯氨酸/谷氨酰胺丰富的氨基末端。由于替代RNA剪接，每个转录可以编码为四个不同的分子量为52-54kDa的蛋白质。一个选择性剪接事件导致第5外显子的包括或排除，第5外显子编码的一段17氨基酸（±17aa）仅仅是4个锌指的N-末端。其他事件涉及第9外显子剪接受体位点的选择，导致存在或不存在的三个氨基酸（赖氨酸-苏氨酸-丝氨酸[±KTS]）插入到锌指的三和四之间。近来，另一种翻译起始位点，已被发现，主要AUG翻译起始位点的上游和下游，分别产生高分子量的（60-62kDa）和低分子量的（36-38kDa）WT1蛋白。RNA编辑也可能会发生，导致亮氨酸由281位的脯氨酸替换。总共有多达24种不同的WT1基因异构体。1.2WT1基因的生理功能WT1蛋白是由WT1编码的一种转录调节因子，分子量为52KD，同时也是足细胞的一种特异性的核心蛋白。它有转录调控域和序列特异性DNA结合域两个功能域。一般情况下，WT1基因的功能是调控细胞生长，抑制其非正常增殖，一旦其功能失常甚至丧失，则会导致细胞无限增长，诱发肿瘤的发生。当WT1基因出现点突变或缺失时，会使其失去结合DNA的能力，造成Wilms’的发生。WT1［7］［8］［8］基因编码的锌指转录因子，可抑制生长因子，RAR-α、c-myc、bcl-2和鸟［9］氨酸脱羧酶等等的目的基因的转录。同时还可以激活视网膜母细胞瘤的有关抑［10］制蛋白如Dax-1等的基因转录。另外，有研究证实WT1基因是一种抑癌基因。40 附录2文献综述但该基因不同于其他抑癌基因，它的表达有一定的组织特异性，仅在脾脏、胎儿肾脏、卵巢和睾丸等组织中表达，在肾脏的形成过程中表达最高。也有学者报道WT1基因还参与其它的恶性肿瘤的发病，如恶性间皮细胞瘤、白血病等。2.WT1和肾脏2.1WT1和正常肾组织发展肾脏通过两种组织的往复相互作用形成:输尿管芽的后肾间充质细胞和上皮细[11]胞。大约人类的E35和小鼠的E11，后肾间质诱导中肾管。其结果是，输尿管芽从中肾管的尾端突出，侵入后肾间质和其分支。一旦输尿管芽诱导后，骨髓间充质细胞进行一阵增殖，接着是输尿管芽周围通过聚集和后续形成的芽基。胚发育成的肾囊泡，进一步通过逗点形和S形机构分化为形成近端小管、远端小管和肾的肾小球的上皮细胞。在肾发生的一开始，WT1基因表达已经可以在未诱导的后肾间充质细胞被检测到。WT1基因表达在发展中胚仍然较低，但作为肾发生的的进展，在逗点形和S形机构表达增加。经过进一步的分化，WT1基因表达下调，只有在成熟肾小球的足细胞，表达保持到成年。2.2WT1和肾小球功能在成熟的肾小球，WT1的表达被限制在足细胞。成人的肾脏有400000-[12]1200000个肾单位。每个肾单位是由肾小球（过滤发生的地方）和近端、远端小管（过滤液体转换成尿液的地方）组成的。[13][14]肾小球主要包含三种类型的细胞：肾小球内皮细胞，肾小球系膜细胞和肾小球脏层上皮细胞，也称为足细胞，每一种都在维持正常肾小球的结构和功能上起着重要作用。在成人肾，WT1继续在足细胞中表达，这表明WT1在这些细胞的功能上的重要作用。为印证这一假说，有小鼠模型表明，WT1基因的破坏[15]可导致肾小球硬化的发展，这种疾病的特征是肾小球周围的细胞外基质的积累。然而，这种潜在的机制，仍有待进一步研究。足细胞在肾小球的血管内成线性分布。它们为肾小球簇提供结构支持，并且参与到维护肾小球的基底膜。WT1基因的破坏导致GBM的增厚早在肾功能衰竭的发展中，而这可能是WT1在正常肾小球功能起作用的一种方式。足细胞也参与在肾小球滤过率的调节。关于后者，足细胞的次级足突形成了肾小球毛细血管外侧相互交叉的模式。这些次级足突被称为裂隙孔膜的超薄膜所分离。滤液依次通过内皮细胞窗孔，GBM和裂孔膜进入肾小囊。肾小球过滤孔的直径和糖基化蛋白质的电荷呈现阻止即使是最小的等离子体白蛋白（69KD）进入滤液。曾经假设足细胞可以改变裂隙孔膜的渗透性，通过足突上的基于微丝的收缩装置。大量的蛋白质参与到裂孔膈膜的运作，而这种基于微丝的收缩装置包[16][17][18][19]括肾病蛋白、CD2AP、podocin分子、细胞标志蛋白和α-辅肌动蛋白41 益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾组织WT1影响的研究[20][21]4。细胞标志蛋白已证明是WT1的靶基因，并有一些证据证明，肾病蛋白的[22]表达也受WT1基因的调节。3.讨论糖尿病肾病的机制是非常复杂的。微量白蛋白尿的发生率是DN的一个重要的早期标志物。它的持久性也预示着肾脏疾病进展的潜在的危险。蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关。肾小球上皮的细胞（足细胞）的是肾小球滤过屏障[23]的最后一层。他们是一类高度分化的细胞，位于肾小球基底膜的外层。足细胞和裂孔隔膜上的一些蛋白质在肾小球滤过屏障的选择性过滤功能上发挥了关键作[24]用。足细胞的损伤会导致足细胞肥大，足突融合，足细胞的丢失，GBM暴露和DM肾小球硬化的发生。DallaVestra发现有微量白蛋白尿或蛋白尿的2型糖尿病的白人患者与足细胞减少、足突宽度增加有关。足细胞的减少与尿蛋白量表现出显着的负相关关系。其他的研究报告说，高血糖，晚期糖基化终产物（AGEs）的，转化生长因子-β（TGF-β），血管紧张素Ⅱ，血管内皮生长因子（VEGF），活[25-29]性氧（ROS），胰岛素抵抗（IR）和其他因素可能引起足细胞凋亡和损失。WT1基因是足细胞的一个标记;在肾小球的三种类型的细胞中，WT1只在足细胞核呈阳性反应。WT1基因的突变会导致各种肾小球疾病，如特发性弥漫性系膜硬化（IDMS），丹尼斯-Drash综合征及其他。由此我们可以看到WT1不仅仅在DN，在其它各种类型的肾脏病种，如肾病综合征、肾小球肾炎、肾功能衰竭等等，它都起着重要作用，因而对它的研究是非常必要，特别是若能从它的表达的起始，找到预防DN，甚至其它各种肾脏疾病的方法，将会是医学上的重大突破。参考文献：[1]Barnett,A.Preventionoflossofrenalfunctionovertimeinpatientswithdiabeticnephropathy.Am.J.Med.119:S40-S47,2006.[2]Lerco,M.M.,C.S.Macedo,R.J.Silva,O.PinheiroDdeandC.T.Spadella.Thenumberofpodocyteandslitdiaphragmisdecreasedinexperimentaldiabeticnephropathy.ActaCir.Bras.21:87-91,2006.3Miyauchi,M.,M.Toyoda,K.Kobayashi,M.Abe,T.Kobayashi,M.Kato,N.Yamamoto,M.Kimura,T.UmezonoandD.Suzuki.Hypertrophyandlossofpodocytesindiabeticnephropathy.Intern.Med.48:1615-1620,2009.[4]White,K.E.andR.W.Bilous.Structuralalterationstothepodocytearerelatedtoproteinuriaintype2diabeticpatiens.Nephrol.Dial.Transplant.19:1437-1440,2004.[5]Schumacher,V,A.,U.Schlotzer-Schrehardt,S.A.Karumanchi,X.Shi,J.Zaia,S.Jeruschke,D.42 附录2文献综述Zhang,H.Pavenstaedt,A.Drenckhan,K.Amann,C.Ng,S.Hartwig,K.H.Ng,J.Ho,J.A.Kreidberg,M.Taglienti,B.Royer-PokoraandX.Ai.WT1-dependentsulfataseexpressionmaintainsthenormalglomerularfiltrationbarrier.J.Am.Soc.Nephrol.22:1286-1296,2011.[6]Su,J.,S.J.Li,Z.H.Chen,C.H.Zeng,H.Zhou,L.S.LiandZ.H.Liu.Evaluationofpodocytelesioninpatientswithdiabeticnephropathy:Wilms’tumor-1proteinusedasapodocytemarker.DiabetesRes.Clin.Pract.87:167-175,2010.[7]GoodyerRDehbiM，TorbanE，eta1．Repressionoftheretinoicacidreceptor-ogenebythewilmstumorsuppressorgeneproduct.wtl.Oncogene.10:1125-1129,1995.[8]HewittSM，HamadaS，McDonnelTJ,eta1.Regulationoftheproto-oncogenesbcl-2andC-mycbytheWilms’tumorsuppressorgeneWTl.CancerRes.55:5386-5389,1995.[9]LiRS.LawOL.SeifeaRA,eta1.Omi吐1jnedecarboxylasejSatranscriptionaltargetoftumorsuppressorWTl.ExpCellRes.247:257-266,1999.[10]KimJ,PrawittD,BardeesyNeta1.TheWilms’tumorsuppressorgene(WTl)productregulatesDax-1geneexpressionduringgonadaldifferentiation.MolCellBi01.19:2289-2299,1999.[11]MenkeAL,HastieND.Wilms’tumor:adevelopmentalanomaly.Tumorsuppressorgenesinhumancancer.1sted.Totowa,NewJersey:HumanaPress,FisherDE;2001.p.307.[12]黎磊石,刘志红等.中国肾脏病学[M].人民军医出版社,2008.8[13]LenzO,StrikerLJ,JacotTA,ElliottSJ,KillenPD,StrikerGE.GlomerularendothelialcellssynthesizecollagensbutlittlegelatinaseAandB.JAmSocNephrol1998;9:2040-7.[14]CortezP,RiserB,YeeJ,NarinsRG.Mechanicalstrainofglomerularmesangialcellsinthepathogenesisofglomerulosclerosis:clinicalimplications.NephrolDialTransplant1999;14:1351-4.15HammesA,GuoJK,LutschG,LehesteJR,LandrockD,ZieglerU,etal.TwosplicevariantsoftheWilms’tumor1genehavedistinctfunctionsduringsexdeterminationandnephronformation.Cell2001;106:319-29.[16]RuotsalainenV,LjungbergP,WartiovaaraJ,LenkkeriU,KestilaM,JalankoH,etal.Nephrinisspecificallylocatedattheslitdiaphragmofglomerularpodocytes.ProcNatlAcadSciUSA1999;96:7962-7.[17]ShihNY,LiJ,KarpitskiiV,NguyenA,DustinML,KanagawaO,etal.CongenitalnephroticsyndromeinmicelackingCD2-associatedprotein.Science1999;286:312-5.[18]BouteN,GribouvalO,RoselliS,BenessyF,LeeH,FuchshuberA,etal.NPHS2,encodingtheglomerularproteinpodocin,ismutatedinautosomalrecessivesteroid-resistantnephroticsyndrome.NatGenet2000;24:349-54.[19]DoyonnasR,KershawDB,DuhmeC,MerkensH,ChelliahS,GrafT,etal.Anuria,43 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