益气养阴活血方治疗糖尿病肾病的实验研究及远期疗效观察

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1、中国中医科学院博士学位论文益气养阴活血方治疗糖尿病肾病的实验研究及远期疗效观察姓名：陈菲菲申请学位级别：博士专业：中医内科学指导教师：张宁20120531益气养阴活血方治疗糖尿病肾病的实验研究及远期疗效观察中文摘要【研究背景】糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见和主要的慢性微血管并发症，早期表现为尿中微量蛋白，继而出现持续蛋白尿、水肿、高血压、肾功能小全，最终发展至终木期肾病(ESRD)。DN时，肾小球系膜细胞是主要的受累细胞，高血糖作为糖尿病最基本的生化特征，可激活胞外信号调节激酶(ERK)通路并增加其下游产物前列腺素E。(PGE。)、转化生

2、长因子(TGF—B。)及纤维连接蛋白(FN)的表达，引起早期肾小球高滤过、细胞外基质(ECM)合成增多，导致DN的发生、发展。目前关于中药复方对DN时ERK通路的影响多数是动物体内试验，体外实验报道较少，且多数侧重在其非血流动力学效应。中医药在防治DN方面有较大优势，国内关于中医药治疗DN的临床研究一般疗程较短，随访超过2年的报道较少，多数采用随机对照试验，用药及治疗方案单一，临床推广性低，且评价指标侧重在实验室指标及临床症状，缺少对终点事件的评价。本课题乃中国中医科学院优势病种的后续研究，益气养阴活血方是导师治疗DN的经验方，短期疗效观察

3、可以降低DN患者尿蛋白排泄率，改善生存质量，但其作用机制之前并未做相关实验研究，且缺乏远期疗效观察。【研究目的】1、实验研究：探讨益气养阴活血方通过抑制肾小球系膜细胞的增殖、ERK通路的活化及其下游产物的表达而治疗糖尿病肾病的作用机制。2、临床研究：整体评价以益气养阴活血方为主的中医辨证治疗糖尿病。肾病的远期疗效，发掘中医治疗本病的特色与优势，为完善中医规范化治疗方案和整体疗效评价体系提供参考。【研究方法】l、实验研究1．1研究对象：大鼠。肾小球系膜细胞。1．2干预措施：以高糖作为刺激因素诱导系膜细胞增殖及ERK通路活化，予益气养阴活血方和

4、福辛普利含药血清加以干预，根据培养条件不同，将系膜细胞分为6组：正常血糖组、高糖组、高糖+福辛普利组和高糖+高、中、低浓度中中国中医科学院2009级博士研究生学位论文药组。1．3观察指标：培养6h、12h、24h、48h、72h后，用Western—blot法检测系膜细胞磷酸化ERK1／2(pERK1／2)蛋白的表达，Realtime—PCR法检测系膜细胞TGF—B，基因的表达，ELISA法检测细胞上清液中PGE。和FN的含量。在培养24h、48h、72h时，用4一甲偶氮唑蓝(MTT)法检测系膜细胞的增殖。2、临床研究2．1研究对象：200

5、6年12月～2009年12月问在望京医院住院或者门诊治疗的糖尿病肾病患者。2．2干预措施：以益气养阴活血方为主的中医辨证治疗作为暴露因素，将既往病例划分为两个队列：(1)中西医结合队列(治疗组)，接受以益气养阴活血方为主的中医辨证治疗+西医基础治疗；(2)西医队列(对照组)，接受单纯西医基础治。对两组病例进行回顾性观察。2．3观察指标：蛋白尿、肾功能进展，终末期肾病(ESRD)和死亡各类终点事件；实验室指标疗效、临床症状疗效和疾病综合疗效；生存质量及营养状态评估。【研究结果】l、实验研究1．1高糖刺激24h、48h后能显著促进系膜细胞增殖，

6、但至72h，高糖促细胞增殖趋势下降，与正常组相比无显著差异。福辛普利和高浓度中药含药血清组均可明显抑制高糖引起的系膜细胞增殖，两组间未见显著差异。中浓度中药组仅在24h表现出明显的抑制作用，低浓度中药组均未见抑制作用。1．2高糖刺激6h后系膜细胞中pERKl／2蛋白的表达即明显升高，随时间延长表达逐渐增高，24h达到高峰，后逐渐减弱，至72h恢复至与正常组同等表达水平。福辛普利和高浓度中药组在6h一48h均显著抑制ERK的活化，两组在各时间点均无明显差异。中浓度中药组在6h一24h亦表现出明显的抑制作用。而低浓度中药组仅在12h可见明显的抑

7、制作用。1．3与正常组相比较，高糖组TGF—p．mRNA的表达从12h开始明显升高，FN的表达则从24h开始明显升高，随着时间延长，至72h升高趋势更为显著。高浓度中药组在各时间点均可显著的抑制TGF一6．mRNA、FN表达的升高。福辛普利益气养阴活血方治疗糖尿病肾病的实验研究及远期疗效观察组在早期有明显抑制作用，中浓度中药组在后期有明显抑制作用。低浓度中药组均未见抑制作用。1．4随着ERK通路的激活，高糖组PGE。的表达在6h即明显升高，48h表达量达到峰值，至72hPGE：的表达较正常组仍有明显升高，但表达量较48h有所降低。高浓度中药

8、组在12—48h可明显抑制PGE：的升高，中浓度中药组在24h、48h亦可明显抑制PGE。的升高。福辛普利组和低浓度中药组均未见抑制作用。2、临床研究本研究共纳入病例105例，其