永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性论文

《永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性论文李羽，白雪帆，王军，徐哲，张岩【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体Establishmentandbiologicalcharacterizationofanimmortalizedhumanfetalhepatocyteline【Abstract】AIM:Toestablishanimmortalizedhumanfetalhepatocytelineandtostudyitsbiologicalcharacteristicsandfunct

2、ions.METHODS:HumanfetalhepatocytesianVirus40largeTantigen.Characteristicsoftheimmortalizedfetalhepatocytelineorphologicandfunctionaldetection.RESULTS:Oneofthehepatocyteclonesdisplayinghighlydifferentiatedinliverfunctionandimmortalizedcharacteristicshadbeensc

3、reenedafter40dayselectionof700-300mg/LG418.Theimmortalizedhepatocytelinemaintainedthemostmorphologiccharacteristicsofprimaryhepatocyte.Thecellcloneformingratmortalizedhumanfetalhepatocyteshadanormalkaryotypeandinandtheimmunohistochemicaltestshoedcellgenome.C

4、ONCLUSION:Theimmortalizedhumanfetalhepatocytelinehasthesimilarmostmorphologiccharacteristicsandbiologicalfunctiontoprimaryhepatocytes,anditaterialonthestudyofbioartificialliverandhepatocytetransplantation.【Keymortalized;hepatocytes;cellline;characterization;

5、SV40;liposomes【摘要】目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究.方法：利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能.结果：经G418700～300mg/L筛选，40d后获得一株阳性克隆.形态学观察发现.freela公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.1.2方法1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV4

6、0LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamHⅠ单酶切，10g/L琼脂糖电泳.回收含目的DNA片段的凝胶，纯化后用T4DNA连接酶与pcDNA3.1空载体进行连接.制备感受态细胞并提取重组质粒.用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10g/L琼脂糖电泳鉴定.1.2.2胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01g/LEDTA，37℃，pH7.4，通以含950mL/LO2及50mL/LCO2的混和气体）以20mL/min的速度灌入，

7、随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉.灌注5min至肝脏变色后改为含0.05g/L胶原酶的Hanks液（37℃，pH7.4，通以含950mL/LO2，50mL/LCO2的混合气体）持续灌注5min.取下肝脏，置于含4℃Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500r/min清洗离心３次，每次2min，弃上清，以4℃Hanks液重悬，台盼蓝（TrypanBlue）染色判断细胞活率，肝细胞活率90％时，计数制成肝细胞悬液，

8、以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素，培养48h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/pcDNA3.1转染至胎肝细胞.用含700mg/LG418的培养液筛选1g/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.1.2.3细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的