肾移植术后受者体内微嵌合状态的研究

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1、肾移植术后受者体内微嵌合状态的研究【关键词】肾移植微嵌合嵌合状态移植物排斥Abstract:Objective:Toinvestigatetherelationshipamongmicrochimerism,allograftfunctionandtheincidenceofrejectionafterrenaltransplantation.Methods:PeripheralbloodmicrochimerismalerecipientsbymeansofnestPCRersfromasexdeterminingre

2、gionofYchromosome.Results:Microchimerismicrochimerismonth,46.67%in6～18monthand71.43%beyondmonth18,respectively.Theoccurrenceofmicrochimerismin10recipients,periodicallymonitoredfromday14tomonth6,dynamicallyfluctuatedinicrochimerismrecipientsicrochimerismisfrequent

3、lydetectedinrecipientsurvivalandassociatedicrochimerism微嵌合现象作为当前免疫抑制下器官移植出现的新特点已得到证实，但有关微嵌合与免疫耐受状态间的关系看法不一。本研究旨在用对人类性别决定基因SRY扩增的巢式PCR方法，分析微嵌合的发生、发展，探讨它与移植肾功能、排斥反应及免疫耐受状态间的关系。1材料和方法1.1一般资料2003年1月至2005年6月，79例接受男性供肾的女性肾移植患者作为研究对象，年龄19～69岁，平均（41.5±13.8）岁。其中71例有妊娠史，胰肾

4、联合移植1例，肝肾移植1例，其供肾均为青年男性。病程在移植术后6个月以内者14例，6～18个月者30例，18个月以上者35例。1.2标本采集采集门诊随访女性患者外周血抗凝血2ml，立即提取DNA，保存于-20℃。其中10例患者为连续观察，在术后第14天开始连续采集标本至第6个月。对所有患者采集标本的同时检测血肌酐值。1.3外周血DNA提取患者DNA提取采用盐析法（DNAIsolationKit，Gentra公司生产）。取300μl全血加入0.98%的NH4Cl1ml破红细胞膜10min，离心后取白细胞加入300μl细胞裂

5、解液，充分混匀后放置10min；加入蛋白质沉淀液150μl充分混匀,离心5min(12000r/min)；取上清液加入异丙醇300μl沉淀DNA；75%乙醇洗3次，待乙醇蒸发后加入溶解液100μl，-20℃保存。1.4实验观察根据人的性别决定基因SRY序列，设计引物对（S1：5'cagtaaaggccaacgtccagg3'，S2：5'cgcattcatcgtgtggtctc3'，A：5'tgttgtccagttgcacttcg3'），引物由上海生工公司合成。患者DNA提取采用盐析法（DNAIsolationKit，Ge

6、ntra公司）。DNA经S1/A引物第一次扩增后，取2μl产物用S2/A进行第二次扩增。二次扩增产物经1%琼脂糖电泳，紫外线仪下观察记录结果。循环条件为：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，总共25个循环，最后72℃延伸10min。扩增仪选用PE-9600，总反应体系为20μl（PCRCoreSystems，Promega）。1.5统计学处理方法不同组间微嵌合发生率比较用Fisher精确概率法检验，微嵌合阳性与阴性患者肌酐值的比较采用t检验。2结果2.1SRY基因PCR扩增结果正常男性DNA扩增产生2

7、90bpY染色体特异片段，而正常女性DNA扩增为阴性，接受男性供肾的女性受者DNA扩增产生阳性条带，即表明发生了嵌合(见图1)。本组79例患者检测结果显示：总的微嵌合发生率为55.70%(44/79)，其中6个月内微嵌合的发生率为35.71%（5/14），6～18个月内发生率为46.67%（14/30），18个月以上发生率为71.43%（25/35）。三组间比较，差别有显著性(P<0.05)。2.210例患者术后14d至6个月连续观察结果微嵌合的出现呈非均一性，以波纹式动态变化为主：术后2w阳性8例，3例持续阳性，

8、2例术后30d转阴，1例术后45d转阴，2例术后60d转阴，1例术后20d转阴并于术后3个月转为阳性。3讨论微嵌合状态（microchimerism）是指接受了同种实质性器官移植的受者体内可检测到供者的细胞或遗传物质的现象。同时，移植的组织内部分细胞如巨噬细胞则被宿主细胞代替，形成一种互相嵌合的状态。1991年Sta