生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响

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1、生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响：宋明宝，于学军，崔馨，陈剑飞，卢来春，赵刚，于世勇，董红梅，黄岚【摘要】目的：观察生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响。方法：采用组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，αactin免疫荧光染色阳性。50μmol/L生胃酮处理平滑肌细胞24h后对缝隙连接蛋白43的表达无影响(0.85±0.06vs0.83±0.03，n=3，P>0.05)。球囊损伤大鼠颈动脉14d后可见血管管腔狭窄、新生内膜增生明显。免疫荧光染色显示形成的新生内膜中缝隙连接蛋白43表达丰富。经生胃酮干预后新生内膜增生明显减轻，新生

2、内膜细胞计数显著低于对照组(89±28.40vs236±15.04，n=5，P<0.01)。结论:缝隙连接在血管损伤后新生内膜形成过程中扮演重要角色，而缝隙连接阻断剂生胃酮能抑制新生内膜过度增生。【关键词】新生内膜;血管;缝隙连接;生胃酮;大鼠　　[Abstract]Objective:Toobservetheeffectofcarbenoxoloneonneointimalhyperplasiaafterratcarotidballooninjury.Methods:RataorticSMCs(RASMCs)munofluorescencestain

3、ingforSMαactin.TheexpressionofCx43inRASMCsol/Lfor24hodelofvascularinjuryalsinistratedg/(kg·d)]inthecarbenoxolonegrouporL/d)inthecontrolgroupfor2alformationoftargetedvessels.AndcellimmunofluorescencestainingmunofluorescencestainingforSMαactin.Inthisexperiment,alformationandthesten

4、osisofbloodvessellumen.EM/F12培养基、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)及DAPI购于美国GibcoBRL公司;生胃酮及兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白(SMαactin)单克隆抗体购于美国Sigma公司;羊抗缝隙连接蛋白43多克隆抗体购于美国SantaCruz公司;FITC标记的兔抗山羊IgG抗体购于北京中杉公司。　　1.1.2实验动物SPF级SpragueDaL培养瓶中，在瓶口用眼科剪剪成约1.5mm×1.5mm大小的组织块，用吸管将组织块随机铺于瓶底，放入37℃、5%CO2的培养箱中贴壁4h后加入含20%FBS

5、及双抗的DMEM/F12培养基继续培养。以后每3d更换培养液1次。采用抗SMαactin免疫荧光染色鉴定血管平滑肌细胞。　　1.2.2生胃酮对大鼠血管平滑肌细胞Cx43表达的影响将培养的大鼠主动脉平滑肌细胞培养3d后加入生胃酮使其终浓度为50μmol/L，置37℃、5%CO2条件下继续培养24h。未加18αGA预处理的细胞作为对照。收集细胞后经裂解液裂解，离心后取上清液，用Log/kg)腹腔麻醉。取颈部正中切口，颈外静脉注射肝素钠100U/kg。无菌条件下游离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，暂时阻断颈总动脉近心端及颈外动脉血流，结扎颈内动脉远心端，用眼科

6、剪在结扎点旁距颈内动脉分叉点约3mm处剪开动脉，将1.5F的Fogarty球囊导管从切口处插入颈总动脉约1.5cm，1.5大气压充盈球囊，使球囊刚好能在血管中拉动，在远心端缓慢回拉球囊至颈内、颈外动脉分叉处，重复拉动3次，每次间隔2min，间隔期球囊处于充盈状态，以使损伤区缺血缺氧。结扎颈内动脉分叉处，常规缝合皮下组织和皮肤。14d后处死动物，取出病变血管及对侧正常血管，OCT包埋后行冰冻切片，经冷丙酮固定5min后进行HE染色以观察新生内膜形成情况。　　1.2.4血管损伤后形成的新生内膜中Cx43表达的检测14d后处死动物。步骤简述如下：(1)PBS漂洗1

7、次;(2)0.3%TritonX100室温下孵育10min;(3)PBS洗涤5min×3次;(4)10%正常兔封闭血清37℃孵育20min;(5)吸弃封闭血清，滴加羊抗Cx43多克隆抗体(1∶100)稀释，阴性对照组用PBS替代一抗，置于湿盒中4℃冰箱过夜;(6)PBS洗涤5min×3次;(7)滴加FITC标记兔抗羊IgG(用0.3%伊文思蓝按1∶200稀释)，37℃孵育60min;(8)PBS洗涤5min×3次;(9)荧光倒置显微镜观察照相。　　1.2.5生胃酮对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响实验分为对照组及生胃酮组。对照组在球囊损伤后给予生理盐水2m

8、L腹腔注射，1次/d。生胃酮组在球囊损伤后给予生胃酮