人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

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1、人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究　　［摘要］目的探讨人脐带间质干细胞（MSC）的分离、纯化、扩增方法，研究其基本生物学特性。方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞，进行原代培养。应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志。绘制细胞生长曲线并测定细胞周期。结果两种分离方法均可获得MSC，原代培养12～14d后可达90%融合，细胞可传代20代以上。流式细胞仪检测结果显示，脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44

2、、CD105，弱表达CD106，不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45。结论脐带MSC在体外有较强的增殖能力，可作为组织工程的种子细胞。　　［关键词］脐带;间质干细胞;生物学;细胞分离　　［ABSTRACT］ObjectiveToexploretheisolation，purificationandexpansionmethodofhumanumbilicalcordderivedmes-enchymalstemcells（UCMSC）.MethodsTheumbilicalcordsf

3、romcesareannealstemcellsedigestmethodandculturedinDMEM/F12medium.SurfaceantigensofUCMSCethods.After12-14daysofprimaryculture，isolatedMSCsreached90%confluenceandthecellscouldexpandatleast20passages.FACSanalysisshobilicalcordderivedMSCshasstrongproliferatio

4、ncapacity，bilicalcord;mesenchymalstemcell;biology;cellseparation　　间质干细胞（MSC）是最早由FRIEDENSTEIN发现，存在于骨髓中的一类成体干细胞，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞，是细胞工程重要的种子细胞之一［1］。近年来，国内外多个实验组报道了骨髓MSC（BMMSC）体外特定条件下能转化为神经元样细胞，使BMMSC受到了越来越多的关注［2］。但在临床上，骨髓取材较困难，供体有限，随年

5、龄增长BMMSC增殖能力、多向分化能力下降，且有病毒污染的可能［3］。这些限制了BMMSC的进一步临床应用。寻找其他的MSC成为近年来的研究热点。新近有研究报道MSC不仅存在于骨髓，还存在于外周血，尤其是脐带血，更有研究报道从胎儿肝脏、肺脏、肾脏等部位提取到了MSC［4］，表明MSC不仅存在于血液系统，也存在于实质组织内。但脐带血MSC含量稀少，分离极其困难，胎儿MSC的应用则受到伦理学的限制。脐带血及胎儿内脏均存在MSC，脐带作为新生儿的一部分并且是分娩废弃物，其中是否也含有并能否提取到足量的MSC引起

6、本研究室的关注。本文拟探讨从脐带获取MSC的方法及其基本生物学特性。　　1材料和方法　　1.1材料脐带组织取自天津市中心妇产医院剖宫产足月新生儿，均经父母授权同意。主要试剂和诱导剂:DMEM/F12培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（Fe-talbovineserum，中国医学科学研究院血液病研究所）、碘化丙啶（BD公司）、胶原酶Ⅳ（Sigma公司）、BrdU（Sigma公司）、兔抗人BrdU抗体（北京中杉生物技术公司）、SP试剂盒（北京中杉生物技术公司）、流式抗体（除FITC-CD105购自Ance

7、ll公司，其余均购自美国BD公司）。RT-PCR试剂购自Invitro-gen公司，引物由上海博亚生物公司合成。　　1.2脐带MSC的分离采用了两种脐带MSC的分离方法，分别是组织块贴壁法和胶原酶消化法。　　1.2.1组织块贴壁法将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入DMEM/F12培养液中，4℃保存，超净台内取出脐带，PBS冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存血。将脐带剪碎至1mm3大小组织块。组织块接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素，100

8、mg/L链霉素）50mL的塑料培养皿中，放置于37℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱内培养。1周后，去掉组织块更换培养液。以后每3d换液1次。细胞长到80%融合时，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L的EDTA混合液消化（在显微镜下控制消化时间），以8.0×103/cm2的密度接种于传代培养瓶（T-25）中进行扩增培养。　　1.2.2胶原酶消化法开始同组织块贴壁法，脐带剪碎至1mm3大小组织块后转移至1g/L胶原酶Ⅳ中