人食管癌及癌旁间质干样细胞分离培养及生物学特性研究

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1、江苏大学硕士学位论文人食管癌及癌旁间质干样细胞分离培养及生物学特性研究姓名：周中卫申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡嘉波20120616江苏大学硕士学位论文要目的探讨人食管癌间质干样细胞(mesenchymalstem．1ikecellsfromhumanesophagealcarcinoma，hEC—MSCs)及癌旁间质干样细胞(mesenchymalstem—likecellsfromhumanesophagealcarcinomaadjacentnon．canceroustissues，hECN．MSCs)体外

2、分离培养方法，鉴定其生物学特性，并对两者进行比较。方法采用胶原酶消化法从25例人食管癌及癌旁组织中分离培养hEC．MSCs及hECN．MSCs，在含有15％FBS的低糖DMEM培养基中培养、增殖并传代；流式细胞仪检测表面标记和细胞周期，绘制生长曲线，检测染色体核型，进行形态学、细胞化学与分子遗传学分析；提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，检测细胞相关基因的表达情况；成骨诱导和成脂诱导检测其多向分化潜能；免疫组织化学技术从蛋白水平比较hEC—MSCs和hECN-MSCs中伐．SMA、CKl8、Nanog及VEGF表达差异；细胞增殖实验

3、、划痕实验和平板克隆实验比较hEC．MSCs和hECN．MSCs的条件培养液(conditionedmedium，CM)对食管癌细胞系EC．1．17的生长、增殖及迁移能力的影响。结果胶原酶消化法分离的25例人食管癌及癌旁组织中，共分离培养出5例配对的hEC．MSCs和hECN．MSCs，所有实验均采用配对细胞进行研究和比较。在形态上两者均呈长梭形，NAP、POX染色均为阴性，PAS染色hECN．MSCs为阳性，而hEC．MSC为弱阳性；生长曲线、细胞周期检测显示hEC．MSCs增殖速率明显高于人食管癌问质干样细胞分离培养及生物学特性

4、比较hECN．MSCs；两者均表达干细胞相关基因Oct一4、Nanog、BMI—l及Nucleostemin及间质细胞相关基因Vimentin、N．cadherin、TGF．p、Twist、0【．SMA、Snail、VEGF和IGF．1，不表达上皮细胞相关基因E．cadherin；相比较hECN—MSCs，hEC—MSCs高表达VEGF、BMI．1、Nanog和Oct-4；流式细胞术结果表明两者均表达问质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)相关表面标记CDl3、CD29、CD44及CDl05，不表达造血或内皮

5、细胞的相关标记CD45、CDl33、CD34及HLA．DR；相比较hECN．MSCs，hEC．MSCs中CDl05表达更强；免疫组织化学分析显示，和hECN．MSCs‘相比，CKl8和VEGF在hEC—MSCs中表达更强，对于a．SMA，两者表达强度相似，而Nanog在hEC．MSCs中呈弱表达，在hECN．MSCs中不表达。hEC．MSCs和娃CN．MSCs均含有46条染色体，核型正常，均具有分化为成骨细胞及脂肪细胞的潜能。细胞增殖实验、划痕实验和平板克隆实验表明，相对hECN．MSCs的CM(conditionedmediumo

6、fhECN．MSCs，hECN．MSCs．CM)而言，hEC．MSCs的CM(conditionedmediumofhEC．MSCs，hEC．MSCs．CM)具有更强地促进食管癌细胞系EC．1．17生长、增殖及迁移的能力。结论采用胶原酶消化法能。有效分离hEC．MSCs和hECN．MSCs，两种细胞的生物学特性存在一定的差异；在细胞生长速率、细胞周期及CM对EC．1．17细胞影响等方面差异较为明显，其原因可能与构成肿瘤基质的hEC．MSCs能够分泌某些细胞因子有关，这些细胞因子也许与食管癌的发生、发展及转移有重要关系。江苏大学硕士学

7、位论文关键词：食管癌，癌旁组织，间质干样细胞，胶原酶III人食管癌间质干样细胞分离培养及生物学特性比较ABSTRACTobjectiveToisolatedmesenchymalstemcell—likecellsfromhumanesophagealcarcinoma(hEC—MSCs)andadjacentnon—canceroustissues(hECN-MSCs)，identifyandcomparetheirdifferenceinbiologicalcharacteristics．MethodshEC-·MSCsandh

8、ECN··MSCswereisolatedbycollagenasedigestionfrom25humanesophagealcarcinomaandadjacentnon—canceroustissues，whichwerecul