人脐带间质干细胞来源exosomes分离鉴定及其对细胞生长的影响

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1、江苏大学硕士学位论文人脐带间质干细胞来源exosomes分离鉴定及其对细胞生长的影响姓名：许文荣申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：沈俐20120620江苏大学硕士学位论文摘要目的：分离培养人脐带间质干细胞(h啪aIlumbilicalcordmesenchymalstemcells’hucMSCs)，建立hucMSCs来源的外切体(hucMSCs．exosomes)分离纯化方法，鉴定并初步分析其生物学特性；体外研究hucMSCs．exosomes对正常细胞的生长及氧化应激导致的细胞损伤的作用。方法：采用脐带组织块贴壁培养法培养hu

2、cMSCs；利用超滤及密度梯度离心法从hucMSCs的条件培养上清中分离并纯化hucMSCs-exosomes，通过透射电镜进行形态学观察及Westemblotting检测exosomes表面相关标志蛋白CD9、CD81，通过蛋白质双向电泳进一步分析其蛋白构成；将分离纯化的hucMSCs．exosomes体外分别应用于正常／过氧化氢损伤的大鼠心肌细胞(H9C2(2．1))、人肝细胞(HL．7702)、大鼠肾上皮细胞(NlⅨ．52E)这三种细胞株，观察hucMSCs．exosomes在体外对正常细胞的生长及氧化应激导致的细胞损伤的干预作用；综合运

3、用MTT、免疫组织化学等技术检测hucMSCs．exosomes对正常细胞的促增殖作用及对氧化应激导致的细胞损伤的预防效果；运用免疫荧光、Westemblotting、Luminex等技术寻找hucMSCs．exosomes影响细胞生长的可能机制。结果：采用超滤及密度梯度离心法成功分离纯化得到hucMSCs分泌的exosomes。透射电镜下观察，hucMSCs．exosomes呈椭圆或碟形的囊泡状结构，直径约为40nm～100nm。hucMSCs．exosomes含有人脐带问质干细胞来源exosomes分离鉴定及其对细胞生长的影响多种蛋白，并在

4、不同的保存条件下有一定的稳定性：蛋白质双向电泳的结果进一步显示人脐带来源的exosom懿和人肺成纤维细胞来源的exosomes具有大量差异性表达的蛋白；westemblotting显示exosom器表达标记蛋白CD9、CD8l。hucMSCs．exosomes对正常培养的H9C2(2．1)、HL．7702、NRK．52E细胞株通过激活ERKl／2起到促增殖作用。对过氧化氢损伤的H9C2(2．1)、HL．7702、NRK．52E，则可在一定程度上逆转细胞损伤，这可能通过活化MAPK通路中p38而起到抗凋亡作用。结论：采用超滤及密度梯度离心法可以成

5、功从人脐带间质干细胞的条件培养上清中分离纯化得到exosomes。hucMSCs来源的exosomes在体外能够通过活化ERKl／2促进细胞增殖，通过活化MAPK通路中p38起到抗凋亡作用。本研究可为进一步开展hucMSCs通过分泌具有活性作用的exosomes来促进组织损伤修复的相关机制研究提供实验基础，也为hucMSCs来源的exosomes作为一种新的非细胞载体的治疗方式提供实验依据。关键词：人脐带间质干细胞，外切体(exosomes)，分离，鉴定，抗凋亡¨江苏大学硕士学位论文ABSTRACTobjectiVe：Toestablisham

6、ethodforex仃actatinga11dpurificatingexosomesf而mhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(hucMSCs)，锄didenti分hucMSCs-deIIiVedexosomes(hucMsCs—exosomes)锄ditsbiologicaIcharacteristics．111isstudyw孙toinVestigatetheeffectsofhucMSCs-exosomes0nⅡlecellprolif．eration觚doxidatiVestress-induc

7、edcellapoptosisin1，ffrD．Methods：HucMSCswereobtainedbywharton’sjellyadherentcultureandexpandedinVf加1．TheconditionedcellculturesupematantsofhucMSCswerecollectedtoextractandpuri矽exosomeswitllultra6ltmtionandgradientcentrimgation．Mo叩holog)，ofeXosomesw弱observedbytransmissionelect

8、ronicmicroscopeandthes删FaceassociatedproteinsofexosomesCD9andCD81wereanalyz