胃癌细胞来源exosomes对间质干细胞作用及机制的研究

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1、江苏大学硕士学位论文摘要目的：探讨胃癌细胞来源的exosomes对人脐带来源间质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hucMSCs)的作用及其机制，研究肿瘤可以通过分泌exosomes的方式作用于肿瘤微环●境细胞从而促进其自身的发展和转移。方法：利用超滤及蔗糖密度梯度离心法从胃癌细胞(SGC7901幂IJHGC27)培养上清中分离并纯化exosomes，通过透射电镜观察形态和大小圾Western．blot检测exosomes标志性蛋白CD9、CD81对其进行鉴定

2、；体外实验将分离纯化的肿瘤细胞来源的exosomes对人脐带间质干细胞作用(hucMSCs)，首先用激光共聚焦和免疫组化检测观察肿瘤exosomes在hucMSCs中的内化和定位。综合运用细胞计数检测肿瘤细胞exosomes对hucMSCs增殖的影响；划痕试验和transwell试验检测肿瘤细胞exosomes对hucMSCs迁移能力的影响；定量PCR’●●●(qRT-PCR)、Westernblotting及免疫荧光等技术分析肿瘤细胞exosomes对hucMSCs的诱导分化作用及TGF．B信号通路在其中发挥

3、●●的重要作用，探讨肿瘤exosomes对MSCs生物学作用的机制。结果：采用超滤及梯度离心法成功分离纯化得到肿瘤细胞分泌的●●exosomes，透射电子显微镜下观察exosomes呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径约30～100nm。肿瘤细胞来源的exosomes表达标志性蛋白CD9、CD81；胃癌细胞来源的exosomes内化和定位于hucMSCs；胃癌细胞来源的exosomes作用后hucMSCs细胞数明显增加且其迁移能力增胃癌细胞来源的exosomes对问质干细胞作用及机制研究加；实时荧光定量RT．PCR及W

4、esternblot显示在胃癌细胞来源exosomes作用下hucMSCs的CAFs标志性基因和蛋白FAP、Q．SMA、Vimentin、N-Cadherin表达增加；胃癌细胞来源exosomes作用hucMSCs后，TGF—B通路中的磷酸化Smad2／3和p38均增加而总的Smad2／3和p38没有变化：TGF—BRI抑制剂SD208作用后Smad2／3和p38●的活化表i擐到抑制。说明胃癌细胞来源的exosomes在体外能促进hucMSCs的生长，促进其迁移且能诱导hucMSCs向CAFs的分化且TGF．B

5、通路在此过程发挥重要作用，为研究肿瘤的发展和转移提供新的思路。结论：采用超滤及梯度离心法可以成功从肿瘤细胞培养上清中分离纯化exosomes。肿瘤细胞来源的exosomes在体外能够肿瘤细胞增殖和迁移，更重要的是诱导其向肿瘤相关成纤维细胞分化，TGF．B通路在肿瘤来源exosomes诱导hucMSCs向CAFs的分化中发挥重要作用。这将为肿瘤与肿瘤微环境相互作用提供新的思路及肿瘤微环境靶向治疗提供实验依据。关键词：间质干细胞，exosomes，肿瘤细胞，CAFs，TGF．BⅡ江苏大学硕士学位论文Objectiv

6、e：ToinvestigatetheeffectsandmechanismofexosomesderivedfromgastriccancercellsonhucMSCs．Toconfirmwhethercancercellcanchangetheirmicroenvironmentthroughexcretingexosomesandpromoteitsprogressionandmetatisis．Methods：Tumoi"cellexosomeswereextractedandpurifiedwithu

7、ltrafiltrationandgradientcentrifugation．Themorphologyo．fexosomewasobservedbytransmissionelectronicmicroscopeandthemarkerofexosomeswereanalyzedbyWestemblot．ThenumberofhucMSCswascounted．ThemigrationofthehucMSCswasanalyzedbytranswellandwoundscratchanalysis．Thee

8、xpressionofCAFsassociatedgenesandproteinswereanalyzedbyQuantitativeRT-PCR(qRT-PCR)andWesternblot．Results：Thetumorcellsderivedexosomesexhibitedellipticorsaucer-likeshapeanditsdiameterrangedfrom30