大鼠骨髓间充质干细胞来源的exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究研究生姓名张志炜指导教师姓名沈振亚专业名称涵K、血管外科学研究方向干细胞移植治疗缺血性心脏病的基础研究论文提交日期2015年3月大鼠骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究中文摘要大鼠骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究中文摘要背景：干细胞移植治疗心肌梗死(myocardialinfarction,MI)已成为全球一大热点。干细胞能够促进血管发生、恢复血供，再生

2、梗死的心肌组织，促使心脏结构和功能性恢复。目前研究报道，可供选择的种子细胞包括间充质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPS）、内皮祖细胞（EPCs）、心脏干细胞（CSCs）等。其中，CSCs因更易向心肌系细胞分化，在治疗MI方面被认为具有巨大潜力。经过多年的动物实验和临床试验研究，现已证实CSCs能够促进受损心肌的修复。然而，CSCs移植治疗MI仍存在着一些困扰，即干细胞存活定植、分化能力欠佳。因此，为了增强CSCs的修复心肌的能力，目前报道的方法有多种，主要包括基因修饰、组蛋白修饰、缺氧预处理等。现已证实BMS

3、Cs-Exosomes具有促进MI区域血管发生、降低心梗面积的能力。另外，有研究报道乳腺癌细胞经BMSCs-Exosomes刺激后，其迁移/侵袭能力明显增强。利用BMSCs-Exosomes刺激CSCs，是否能够促进CSCs活化、提高CSCs分化能力，增强CSCs心肌修复功能？这些问题目前仍未有研究报道。本课题拟以Exosomes为手段预处理CSCs，旨在为提高CSCs的心肌修复功能；并进一步通过microRNA基因芯片检测，探讨分析CSCs功能改善的基因调控机制。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养，及Exosomes的提取第一节MS

4、Cs的分离、培养和鉴定目的：从大鼠的骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)。为进一步获取Exosomes作准备。方法：SD大鼠全骨髓细胞贴壁培养，多次传代纯化。对分离纯化的MSCs进行多方面鉴定：流式细胞术鉴定BMSCs表面标记抗原的表达；绘制MSCs生长曲线；检测MSCs的细胞周期。I中文摘要大鼠骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究结果：全骨髓细胞贴壁培养14天左右，基本已铺满培养皿，融合达90%以上。传代后，细胞增殖速度明显加快，4-

5、6天即可传代一次。细胞形态比较均一，呈纺锤形。流式鉴定：超过90%BMSCs表达CD29、CD90和CD44，但不表达CD34。P3MSCs生长曲线呈现：细胞接种后前2天为潜伏期生长；第3天，细胞开始增殖；第4、5、6天扩增明显加速，进入对数增殖期；第7天增殖达到高峰，进入平台期。流式细胞仪检测P3MSCs细胞周期：G0/G1期占88.15%，G2期为1.73%，S期(G3)为10.12%，大部分细胞处于静止期，符合干细胞特征。结论：利用大鼠全骨髓细胞，贴壁传代培养，至P3可使MSCs得到纯化，有效的培养出大鼠BMSCs。第二节BMSCs来

6、源Exosomes的提取、鉴定目的：从P3BMSCs培养上清液中提取具有特定形态、大小和膜标记物的Exosomes。为进一步应用Exosomes处理CSCs做准备。方法：应用Exosomes提取试剂盒，按说明抽提P3BMSCs培养上清液中的Exosomes。利用BCA试剂盒测定Exosomes的浓度。对Exosomes进行鉴定：透射电镜下观察Exosomes的大小、形态；流式细胞术鉴定Exosomes表面CD63的表达量；WesternBlot检测Exosomes中CD63的蛋白表达量。结果：经BCA试剂盒测定，Exosomes蛋白浓度较高

7、，达1896.7mg/ml。对Exosomes鉴定：透射电镜下观察，Exosomes大小不一、圆形或椭圆形，呈囊状小泡，腔内可见低密度光亮区，平均直径为46.55±11.64(11-98nm)；经流式细胞术检测，CD63的表达量为96.7%；经WesternBlot检测，CD63蛋白为阳性表达。结论：试剂盒抽提的Exosomes浓度较高。经透射电镜、流式细胞术和WesternBlot鉴定，符合Exosomes形态及特征。试剂盒抽提Exosomes简便、省时、高效。第二部分大鼠心肌梗死模型的建立目的：气管插管开胸直视下，行大鼠冠状动脉前降支（

8、LAD）结扎，建立大鼠心肌梗死模型。方法：17只SD大鼠，体重250g-300g，分为两组：MI组（10只）和对照组（7只）。MI组在气管插管下，开胸直视结扎大鼠冠状动脉前降支（