大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖影响的体外实验

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1、大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖影响的体外实验【摘要】目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。方法:常规分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)及淋巴细胞,灭活后的骨髓间充质干细胞和淋巴细胞混合培养48h后，MTT法检测淋巴细胞的相对细胞数，Hoechst33258染色观察细胞核变化。结果:MTT结果显示，加入MSCs组OD值明显低于未加MSCs的对照组（p＜0.05）。Hoechst33258染色显示MSCs组淋巴细胞有核固缩及凋亡小体出现。结论:MSCs对淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用机制可能与细胞凋亡有关。【关键

2、词】间充质干细胞；淋巴细胞；细胞增殖骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在造血调控、组织工程和基因治疗等方面具有广阔的临床应用前景。已有实验表明体外扩增培养的MSC可以抑制混合淋巴细胞反应,减轻移植排斥,延长移植物的生存时间等,其免疫调节功能研究已是移植治疗中的研究热点[1-3]。我们实验显示MSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用明显，其作用机制可能与细胞凋亡有关。现将结果报道如下。1材料和方法61.1主要试剂及仪器SD大鼠购自四川大学华西医学中心动物中心,6周龄，体重约60～80g。DMEM、RPMI1640培

3、养基（美国Gibco公司），淋巴细胞分离液(Pharmacia公司),IL2(Sigma公司),青霉素、链霉素（华北制药有限公司），小牛血清（兰州中美合资民海生物有限公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），超净工作台(日本NUAIR公司),二氧化碳培养箱（日本SANYO公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），全自动酶标仪（德国BIORAD，Model550)。1.2方法1.2.1大鼠MSCs的分离和培养采用全骨髓培养法分离培养MSCs。48h后弃悬浮细胞，继续培养已贴壁细胞。细胞生长至80～90％融合后，改用10%小牛血清

4、的DMEM低糖培养基传代培养。1.2.2大鼠脾脏淋巴细胞的制备无菌取出大鼠脾脏，研磨过尼龙网，分散的淋巴细胞透过尼龙网后应用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞。洗涤2次后重悬于10%小牛血清的RPIM1640培养基中。在37℃饱和湿度的CO2孵箱中孵育2-4h后，收集未贴壁悬浮细胞。1.2.3MTT法淋巴细胞混合反应实验6取第三代对数生长期MSCs经30Gy60Co照射后按1×104个/孔，淋巴细胞按5×104个/孔的种入96孔板中，各孔均加入刺激剂IL2（1000U·mL-1）。37℃饱和湿度CO2孵箱中孵育48h，MTT法检测淋巴细胞相

5、对细胞数。1.2.4Hoechst33258染色经30Gy60Co照射后的MSCs与淋巴细胞按1:5比例接种于含10%胎牛血清的RPIM1640培养基的25cm2培养瓶中，并加入刺激剂为IL2（1000U·mL-1）。CO2孵箱中培养48h后采用50μg·mL-1Hoechst33258染色10min，PBS洗涤2次后涂片，荧光显微镜下观察细胞核。2结果2.1MSC的分离、培养及鉴定MSC通常在培养2天左右,可以出现单个分散存在或形成只有几个细胞的克隆,细胞形态呈长梭形。贴壁的MSC增殖迅速,培养10天左右每个克隆包含100-200

6、个细胞,12-15天时细胞呈现80-90%融合(图1)。体外分化实验显示其能分化为成骨、成软骨及神经等多种细胞。图1原代培养第3代大鼠骨髓间充质干细胞2.2MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果MTT结果显示加入MSCs的实验组淋巴细胞数比未加MSCs的对照组明显减少，并具有统计学意义（p＜0.01），见表1。表16MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果*注：*与对照组相比，p＜0.012.3Hoechst33258染色结果经IL2刺激培养48h后，与MSCs共同培养的淋巴细胞有分裂的细胞核碎片出现，而未加MSCs的淋巴细胞细胞核完整，没有核固缩

7、和核脆裂现象。MSCs的实验组淋巴细胞凋亡率明显升高（p＜0.01），见表1。3讨论对MSC功能研究发现,其除可以作为组织工程研究的种子细胞外,还具有支持体外造血,促进体内造血重建的功能。最近研究发现MSC具有免疫负调节作用，如诱导免疫耐受，抑制排斥反应，提高器官移植的成功率并能减轻自身免疫疾病的病情等[2-5]。本实验证实MSCs可在体外显著抑制由IL2引起的淋巴细胞增殖，同Bartholomew等[3,4]报道一致。已有研究表明MSCs不仅引起了淋巴细胞的增殖停滞，还可能诱导了淋巴细胞的凋亡或死亡。如Plumas[6]等发现MSC

8、s可以引起活化淋巴细胞凋亡的发生，其原因可能与吲哚胺2，3－二氧化酶的作用有关。我们也发现与MSCs共同培养48h后的淋巴细胞出现核固缩及分裂的细胞核小块，推测MSCs可能诱导了淋巴细胞的凋亡，但其作用机制