5氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

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1、5氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响作者：陈凯佳刘小斌邱仕君周健洪肖莹【摘要】【目的】观察5氮杂胞苷（5Aza）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖和成肌分化的影响。【方法】无菌条件下取SD大鼠骨髓组织，采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后，随机分为4组：浓度为5、10、15μmol/L的5Aza组和空白对照组，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度5Aza对MSCs生长增殖的影响；以含5、10、20μmol/L5Aza的培养基诱导培养MSCs24h后，改用完全培养基继续培养，采用免疫组

2、织染色法鉴定5Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白（myosin）和结蛋白（desmin）的表达情况。【结果】双标免疫组化染色结果显示：所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54，表达率达96%，鉴定结果表明所培养细胞为MSCs；5、10μmol/L5Aza对MSCs增殖无显著影响（P＞0.05），15μmol/L5Aza可显著抑制MSCs生长（P＜0.05）；不同浓度5Aza诱导培养MSCs后第3天，部分细胞出现desmin阳性表达，诱导后14d，部分细胞表达myosin，以10μmol/L5Aza组作用为佳。【结论】高浓度5Aza

3、可抑制MSCs体外增殖；适宜浓度的5Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化。【关键词】骨髓间充质干细胞/病理学；5氮杂胞苷/药理学；细胞培养，体外的；蛋白表达骨髓间充质细胞（MSCs）是干细胞中的一种，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，能在一定的诱导条件下向成肌细胞分化［1］。本研究观察5氮杂胞苷（5Aza）对大鼠MSCs增殖与成肌分化的影响。现报道如下。1材料与方法1.1动物纯种SD大鼠，SPF级，4周龄，体质量90～130g，用于MSCs的提取。由广州中医药大学实验动物中心提供，许可

4、证号：粤鉴证字2005A031SCX（粤）20030001。1.2主要试剂与仪器IMDM培养基、特级胎牛血清（FBS）为美国GIBCOL公司产品；链霉亲和素生物素复合物（SABC）、二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒、抗体CD54、增殖细胞核抗原（PA）、生物素化二抗（羊抗小鼠）、DAB显色剂、5溴4氯3吲哚磷酸/氮蓝四唑盐（BCTP/NBT）显色剂均为武汉博士德公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、5溴脱氧嘧啶（Brdu）及其单克隆小鼠抗体均为SIGMA公司产品；5氮杂胞苷（5Aza）、DHanks液、Tris盐缓冲液（TBS）、磷酸盐缓冲液（PB

5、S）、20g/L台盼蓝染液、2.5g/L胰酶、马血清均由广州威佳公司提供；鼠抗人肌凝蛋白（myosin）、鼠抗人结蛋白（desmin）为武汉博士德公司产品；BB36UU型CO2培养箱为德国Heraeus公司产品，设置37℃、CO2浓度为体积分数5%；CHK2FGS型显微镜为日本OLYMPUS公司产品；XDSIB型倒置显微镜为重庆光电产品；PE1420多功能微板分析仪为上海PerkinElmer产品；超净台（PURIFIATIONEPUIPMENT）为苏州净化设备有限公司产品；TGL16G型离心机为上海安亭产品；YH1401型电热恒温水箱为广州东方产品。1.3

6、MSCs分离及体外扩增取4周龄SPF级SD大鼠4只，100g/L水合氯醛腹腔注射以麻醉动物。无菌条件下取双股骨及胫骨，收集骨髓腔内组织细胞，将细胞悬液分装，2000r/min×20min密度梯度离心2次，收取单核细胞层，加入IMDM培养液，打散成细胞悬液。细胞悬液用20g/L台盼蓝染液染色，计数300个细胞，调整密度，染色蓝色的死细胞小于5%方可继续实验，计数板计数，按1×104个/瓶密度接种于75cm2培养瓶上，置于37℃、体积分数5%饱和湿度的CO2培养箱中培养，2d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3d换液1次，细胞培养7～10d后细胞密度较高，达90%融合

7、后，弃去培养液，加入DHanks缓冲液进行冲洗，2.5g/L的胰蛋白酶37℃条件下消化5～10min，镜下观察消化控制时间，当细胞形态开始变化、变圆、漂浮、脱壁，立即加入血清终止消化反应。常规按1∶2或1∶3比例传代。1.4双标免疫组化法检测传3代后的细胞种入装有IMDM空白培养基的24孔板中，24h后固定；0.01mol/LTBS洗10min+5min，体积分数3%H2O2洗涤10min，蒸馏水洗2min×3次，正常山羊血清封闭20min，用去多余液体，一抗用多克隆兔抗，CD44、CD54（1∶100）4℃过夜（对照组不加一抗，加T