大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖影响的体外实验论文

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1、大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖影响的体外实验论文【摘要】目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。方法:常规分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)及淋巴细胞,灭活后的骨髓间充质干细胞和淋巴细胞混合培养48h后,MTT法检测淋巴细胞的相对细胞数,Hoechst33258染色观察细胞核变化。结果:MTT结果显示,加入MSCs组OD值明显低于未加MSCs的对照组(p<0.05)。Hoechst33258染色显示MSCs组淋巴细胞有核固缩及凋亡小体出现。结论:MSCs对淋巴细胞的增殖有抑制作用,其作用机制可

2、能与细胞凋亡有关。【关键词】间充质干细胞;淋巴细胞;细胞增殖骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,在造血调控、组织工程和基因治疗等方面具有广阔的临床应用前景。已有实验表明体外扩增培养的MSC可以抑制混合淋巴细胞反应,减轻移植排斥,延长移植物的生存时间等,其免疫调节功能研究已是移植治疗中的研究热点1-3。我们实验显示MSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用明显,其作用机制可能与细胞凋亡有关。现将结果报道如下。1材料和方法1.1主要试剂及仪器SD大鼠购自四川大学华西医学中心动物中心,6周龄,体重约60~

3、80g。DMEM、RPMI1640培养基(美国Gibco公司).freelacia公司),IL2(Sigma公司),青霉素、链霉素(华北制药有限公司),小牛血清(兰州中美合资民海生物有限公司),胰蛋白酶(美国Gibco公司),超净工作台(日本NUAIR公司),二氧化碳培养箱(日本SANYO公司),倒置相差显微镜(日本Olympus公司),全自动酶标仪(德国BIORAD,Model550)。1.2方法1.2.1大鼠MSCs的分离和培养采用全骨髓培养法分离培养MSCs。48h后弃悬浮细胞,继续培养已贴壁细胞。细胞生

4、长至80~90%融合后,改用10%小牛血清的DMEM低糖培养基传代培养。1.2.2大鼠脾脏淋巴细胞的制备无菌取出大鼠脾脏,研磨过尼龙网,分散的淋巴细胞透过尼龙网后应用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞。洗涤2次后重悬于10%小牛血清的RPIM1640培养基中。在37℃饱和湿度的CO2孵箱中孵育2-4h后,收集未贴壁悬浮细胞。1.2.3MTT法淋巴细胞混合反应实验取第三代对数生长期MSCs经30Gy60Co照射后按1×104个/孔,淋巴细胞按5×104个/孔的种入96孔板中,各孔均加入刺激剂IL2(1000U·mL-1)。

5、37℃饱和湿度CO2孵箱中孵育48h,MTT法检测淋巴细胞相对细胞数。1.2.4Hoechst33258染色经30Gy60Co照射后的MSCs与淋巴细胞按1:5比例接种于含10%胎牛血清的RPIM1640培养基的25cm2培养瓶中,并加入刺激剂为IL2(1000U·mL-1)。CO2孵箱中培养48h后采用50μg·mL-1Hoechst33258染色10min,PBS洗涤2次后涂片,荧光显微镜下观察细胞核。2结果2.1MSC的分离、培养及鉴定MSC通常在培养2天左右,可以出现单个分散存在或形成只有几个细胞的克隆,

6、细胞形态呈长梭形。贴壁的MSC增殖迅速,培养10天左右每个克隆包含100-200个细胞,12-15天时细胞呈现80-90%融合(图1)。体外分化实验显示其能分化为成骨、成软骨及神经等多种细胞。图1原代培养第3代大鼠骨髓间充质干细胞2.2MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果MTT结果显示加入MSCs的实验组淋巴细胞数比未加MSCs的对照组明显减少,并具有统计学意义(p<0.01),见表1。表1MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果*注:*与对照组相比,p<0.012.3Hoechst33258染色结果经IL2刺激培养48h后,

7、与MSCs共同培养的淋巴细胞有分裂的细胞核碎片出现,而未加MSCs的淋巴细胞细胞核完整,没有核固缩和核脆裂现象。MSCs的实验组淋巴细胞凋亡率明显升高(p<0.01),见表1。3讨论对MSC功能研究发现,.freeleas6等发现MSCs可以引起活化淋巴细胞凋亡的发生,其原因可能与吲哚胺2,3-二氧化酶的作用有关。我们也发现与MSCs共同培养48h后的淋巴细胞出现核固缩及分裂的细胞核小块,推测MSCs可能诱导了淋巴细胞的凋亡,但其作用机制尚待进一步研究。总之,MSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用确切,有望在移植治疗中得到

8、拓展及应用。【

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