人脐带间质干细胞来源exosomes预防顺铂诱导hk2细胞损伤实验地研究论文

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1、分类号墅三!：!UDC612密级垒珏编号10299S1114023江薛大擎硕士学位论文人脐带间质干细胞来源的exosomes预防顺铂诱导的IⅡ(-2细胞损伤的实验研究EXoSoMESDERⅣEDFROMHUM队NUⅣIBILICALCoRDMESENCHYMALSTEMCELLSPREVENTCISPLAT矾矾DUCEDHK．2CELL矾JURY作者姓名：蒋留留指导教师：钱晖教授小组成员：严永敏副教授毛飞副教授申请学位：医学硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年4月28日论文答辩日期：2014年6月10日学位授予单位

2、：江苏大学学位授予口期：2014年6月答辩委员会主席：许文荣教授评阅人：基金资助：国家自然科学基金(81272481，31340040)：江苏高校优秀科技创新团队((苏教科(2013)10号))；江苏省医学领军人才与创新团队(IJ201117)；独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位

3、论文作者签名：甭岛压日期：必?妒年<月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：獠％指导教师签名：压扩一乃印年么月，J日加印年∥月‘／日江苏大学硕士学位论文摘要目的建立人脐带问质干细胞来源的CXOSOIT七S(hucMSC—Ex)预防顺铂诱导的HK．2细胞损伤模型

4、，评价其对顺铂诱导的HK．2细胞损伤的预防保护作用。通过对自噬相关分子的分析检测，探讨细胞自噬作用在其中发挥的重要作用，并初步阐明hucMSC—Ex预防顺铂诱导的HI(．2细胞损伤的相关分子作用机制。方法收集无血清培养的人脐带间质干细胞(hucMSCs)和人成纤维细胞(HFLl)的培养上清，以ExoQuick．TcTM试剂盒分离纯化两种细胞来源的CXOSOII℃S。透射电子显微镜和Nanosight纳米颗粒示踪技术观察exosomes的形态大小，免疫胶体金技术、流式细胞术和WesternBlot技术检测其生物学标记。构建hucMS

5、C—Ex预防顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HK一2)损伤模型，分组设置为：正常对照(Normal)组、Cisp+PBS组、Cisp+hucMSC—Ex组和Cisp+心L1．Ex组。预先加入hucMSC—Ex处理，然后经顺铂诱导处理16h后收集细胞标本；WesternBlot，TUNEL，免疫荧光、流式细胞术以及MTT等技术分别检测HK一2细胞的增殖、凋亡和自噬等相关指标。提取细胞RNA，然后逆转录为cDNA并利用qRT-PCR技术检测HK．2细胞自噬相关基因的表达情况。提取exosonleS中的miRNAs，并利用qRT-PCR技术

6、检测hucMSC—Ex和HFLl一Ex中的miRNAs；同时提取hucMSC—Ex预处理的于不同时间点经顺铂诱导HI(．2细胞的miRNAs，检测其中mllR-155的表达。结果透射电子显微镜和Nanosight分析发现分离纯化的hucMSC．Ex呈圆形，免疫电镜、流式细胞术和WesternBlot检测CD9、CD8l、CD63以及CD44等eXOSOITICS相关标记蛋白。HK．2细胞经顺铂处理后，细胞形态由圆形或椭圆形变为纤维状或梭形；同时凋亡蛋向Bax的表达在一定范围内随着顺铂浓度以及作用时间的增加而增加。hucMSC．Ex

7、预处理HK．2细胞后，结果显示hucMSC—Ex能促进顺铂诱导的HK．2细胞增殖蛋白PCNA的表达，细胞增殖能力有所增强；促进抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2以及细胞周期蛋白CyclinD1的表达；抑制HK．2细胞捌亡蛋白Bax的表达和TUNEL阳。陡细胞数目增多；同时也促进J，P13K／AKT通路相关蛋白P13K和AKT蛋白的表达：相应地，hucMSC—Ex预处理HK一2细人脐带问质干细胞来源的e∞osomes预防顺铂诱导的HK-2细胞损伤的实验研究胞后，细胞白噬相关基因ATG5和ATG7的表达上调，自噬相关蛋白LC一3B和B

8、eclinl的表达增强：然而自噬内源性抑制分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mamrmfiantargetofrapamycin，mTOR)的活化却受到相应的抑制，而HFLl一Ex预处理后则无明显的上述作用。QRT-PCR检测发现hucMSC。Ex和HF