犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索

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1、犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索：苏冠华,刘启云,卢永昕,米少华,孙雨霏,刘晓明,帅欣欣【摘要】　　目的:探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMs）体外分离、纯化及培养方法的改良并研究其生物学特性。方法:采用机械分离结合Ⅱ型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞,经差速贴壁法纯化后,在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM）中进行原代和传代培养,免疫细胞化学染色鉴定。结果:改良后的培养方法适于获取犬骨骼肌成肌细胞,SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。结蛋白（desmin

2、）单克隆抗体（mAb）细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性,纯度在90%以上。结论:通过改良后的双酶一步消化法获得的SkMs在合适的培养条件下能够增殖、分化并保持其生物学特性,为其在基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。【关键词】犬;骨骼肌成肌细胞;细胞培养;生物学特性　　1961年,Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞（musclesatellitecells）。从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletalmyoblasts,SkMs)。于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便

3、、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点［1］。因此,成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。本研究以获取基因治疗载体SkMs为目的,探讨建立简便、经济的成肌细胞分离、纯化及培养方法。　　1材料和方法　　1.1材料　　实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。中性蛋白酶购自美国Roche公司,Ⅱ型胶原酶、结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自美国Sigma公司;SKBM培养基和SKGMBulletKit购自美国Lo

4、nza公司;亲和素生物素过氧化物复合物法（avidinbiotinplex,ABC）免疫组化试剂盒购自美国Vector公司,DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司;胰蛋白酶、DMEM、M199培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）,小牛血清购自美国Gibco公司。　　1.2方法　　1.2.1SkMs的原代培养　　完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM∶DMEM∶FBS＝70∶25∶5配制。无菌全麻下自5～8kg左右杂种犬股四头肌取3～5g肌肉,将其移入盛有PBS的90mm培养皿中剔除筋

5、膜、脂肪、肌腱和血管组织后剪为碎糜状,将组织块移入盛有约30mL的4g/L中性蛋白酶和1g/LⅡ型胶原酶混合消化酶溶液的100mL玻璃瓶中,37℃恒温摇床60r/min,1h。然后吸取9mL上清液经孔径75μm的不锈钢网筛（200目）过滤到10mL玻璃离心管中,再加入1mLFBS中和,1000r/min,离心5min,弃上清。加70SKGM培养基重悬细胞沉淀,种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩余的组织块,反复3～4次。计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。2d后换液,以后每2～3d换液1次,在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。　　1

6、.2.2SkMs的传代培养及纯化　　倒置显微镜下观察细胞生长情况,当细胞生长到培养瓶面积的70%～80%时,以2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA混合溶液消化,中止消化后离心,重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶,静置于培养箱内约8～10min后取出,轻轻晃动培养瓶,动员未贴壁的细胞,吸出培养液接种另一培养瓶,反复差速3次。最后按1∶2或1∶3比例进行传代,每2～3d换液1次。4g/L台盼蓝染色确认细胞成活率。　　1.2.3SkMs细胞生长曲线测定　　取处于对数生长期的细胞,用上述EDTA/胰酶溶液消化后制成单细胞悬液,细胞计数后以5×103

7、细胞/孔接种于24孔板,共接种8组,每组3孔,每天取一组细胞进行计数,计算平均值,连续8d,绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每2～3d换液1次。　　1.2.4SkMs的诱导分化　　取培养至第2～3代的细胞,消化后以1×105细胞/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基进行培养,待细胞分裂、增殖至70%～80%汇合后,加入分化培养基（含200mL/LFBS的M199培养基）继续培养,倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。　　1.2.5SkMs的免疫细胞化学染色　　　　将细胞接种于有盖玻片的6孔板,待长至培养面积的80%取盖玻片。40g/L多聚

8、甲醛固定后,以ABC法行免疫化学染色,以鼠抗desminmAb为一抗,DAB显色。　　1.2.6差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞de