BMSCs分离培养、纯化及鉴定.doc

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1、BMSCs分离培养、纯化及鉴定作者：马民吕志刚杜以宽张桂娟马义【摘要】目的建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养体系。方法运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs,利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红0进行染色鉴定。结果所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合B

2、MSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性。【关键词】骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化[Abstract】ObjectiveToestablishasustainedandstablebonemarrowderivedmesenchymalstemcells(BMSCs)isolationandculturesystemwhichcouldbeplur

3、ipotentialinvitro.MethodsBMSCswereisolatedandculturedfromthe1montholdNewZealandwhiterabbitsthroughdensitygradientcentrifugatiori.GrowthandultromicrostructureoftheBMSCswereobservedbylightmicroscopeandscanelectronmicroscope・Thecellactivitiesandcellcyclewereobserv

4、edbyf1owcytometry.ThegrowcurveoftheBMSCswasdescribedthroughMTTassay.BMSCswereinducedanddifferentiateintoosteoblastsandadipocytesbyspecificinduetionculturemedium.Thenthecellswerestainedwithalkalinephosphatase(ALP)andOilred0,andanalyzedtheresuItofallstaining.Resu

5、ltsTheisolatedBMSCscellswereinlinewiththecharacteristicsofBMSCsinmorphologyandgrowthkinetics,andtheisolatedBMSCscellswouldbeintothelogarithmicgrowthphaseinthethirddayandintotheplatformphaseinthetenthday.ConclusionsIntheosteogenicandadipogenicinducedculturecondi

6、tions,BMSCshaveappearedthephenotypiccharacteristicsofosteogenicandadipogenicrespectively,andcouldbefurtherdirecteddifferentiation.TheseindicatedtheharvestedcellspossessedBMSCsspecificity.【Keywords]Bonemarrowderivedmesenchymalstemcells（BMSCs）；Isolation；Osteogeni

7、cdifferentiation；Adipogenicdifferentiation软骨组织工程技术（自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点（1,2）0特别是自体BMSCs,因其低免疫原性、无限扩增性及多向分化潜能等诸多优点而引起广泛关注，成为软骨组织工程种子细胞的首选来源。本实验选择合适的BMSCs体外分离、纯化和扩增方法，并通过形态学观察（光镜、电镜）、细胞周期（流式细胞仪）、多细胞系（成骨细胞,脂肪细胞

8、）分化能力对其进行鉴定，以期建立一种较理想的BMSCs培养体系，为BMSCs的临床应用提供理论依据和技术方法。1材料与方法1.1材料1月龄健康新西兰兔，雌雄不限，由广东省动物实验中心提供（合格证号：2006A024）oPercoll细胞分离液购自Pharmacia公司；4発乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和胰酶购自Amersco公司；嗟哇兰（MTT