人骨骼肌成肌细胞的分离培养

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1、摘要中文摘要由于心肌细胞是终末分化细胞，不能再生，而且心脏内没有心肌于细胞，因此心肌细胞损伤后只能通过瘢痕组织来修复，大量有收缩功能的细胞流失必然造成心室重构和心功能降低，最后导致患者终末期心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)，死亡。目前治疗心衰的方法很多，包括药物、PTCA支架置入术和冠状动脉旁路移植术(cABG)、心脏移植及基因治疗等，可通过降低心肌耗氧量、增加心肌血供、增强心肌收缩力及减轻心室重构等方法一定程度上延长患者生存期，但均不能从根本上解决心肌丢失的问题，不能逆转心室重构，使治疗效果受到限制。近年来，利用细胞移植的方法重塑坏死区的心肌结构受到广泛

2、的关注，但由于供体的匮乏和异体移植带来的排斥反应，使胚胎心肌细胞、胚胎干细胞或成体干／祖细胞受到很大限制。而骨骼肌成肌细胞可自体移植，不受供体来源限制，不需免疫抑制，故备受关注。本实验旨在探索高效的人骨骼肌成肌细胞分离培养方法，为临床应用自体成肌细胞移植治疗心衰打下良好基础。方法：1．采用组织块反复贴壁法原代培养人骨髂肌成肌细胞，观察成肌细胞生长的形态学变化；2．利用骨骼肌特异性标记物肌动蛋白(Actirt)及结蛋白(desmin)对培养细胞进行免疫组化鉴定；3．将原代培养的成肌细胞多次传代，同时对原代及传代培养的成肌细胞计数，绘制其生长曲线，观察成肌细胞增殖分化特性；4．探索成肌

3、细胞冻存及复苏的方法。结果：1．形态学观察：采用组织块贴壁培养法，肌组织块接种于培养瓶5天后可见长梭形、纺锤形单核成肌细胞缓慢向组织块外生长，第6天后单核双极性成肌细胞向组织块外大量扩展呈铺开状放射样分布，生长迅速，远离组织块区域的成肌细胞可里典型的克隆样生长和簇状分布，表现出很强的分裂增殖生长特性。8—10天后，大量增殖的成肌细胞相互融合，形成核位于中央的多核性长管状初生肌管。因此上述原代培养的肌细胞成肌过程大致分为缓慢生长期、分裂增殖期及肌管形成期3个不同的生长增殖分化期，时间分别为培养的第1-5天、6--8天、8--10天。在保持适宜的细胞密度和细胞培养条件下，组织块至少可以

4、反复贴壁12次，而细胞形态保持不变。2．免疫组织化学鉴定：骨骼肌特摘要异性标记物肌动蛋白(Actin)和结蛋白(desmin)免疫组化鉴定为阳性，证实了培养细胞的骨骼肌来源。3．骨骼肌成肌细胞增殖分化特性：采用组织块反复贴壁培养法，肌组织块贴壁后5天即开始有细胞从组织块边缘爬出，6—8天时生长旺盛，10天时长满瓶底，可达1．6×104／cm2；原代培养细胞共贴壁12次，随着贴壁次数增多，细胞爬出的速度增快，约在第10次时最快，3天即可见有细胞爬出。原代培养的细胞至少可以传代20次以上，在第10～15代时细胞增殖最为迅速，细胞倍增时间为24小时。4．冻存与复苏：成肌细胞冻存、复苏后生

5、长良好，仍可保持原有形态及增殖分化特性。结论：与酶消化法相比，组织块贴壁法简便、可行，耗材少，时间短、成本低。该方法实用性强，可在短时间内得到大量的高纯度的成肌细胞，是原代培养人骨骼肌成肌细胞的较好方法。同时，可通过适当的冻存及复苏方法使培养细胞得以长时间保存，为适时临床细胞移植治疗打下良好基础。关键词：骨骼肌成肌细胞细胞培养组织块反复贴壁法增殖冻存复苏IIAbstractAbs仃actMaturemyocardialtissuesdoesnotpossesstheabilitytoeffectivelyregenerateafterischemicinjury．Asaresult

6、，thenormalprogressionofinjuredmyocardiuminvolvesdevelopmentoffibrous，nonconstractilescartissue，leadingtoventricularremodeling，whichCallcauseaneurysmformationandend—stageheanfailure，evendeath．Nowtherearemanytreatmentsforheartfailure，includingdrugs、PTCA、hearttransplantion、genetherapyete，whichare

7、unabletoreconstructinjuredmyocardium．Transplantionreversecellsintoinfractedregionofmyocardiumoffersthehopeofrestoringsomeventricularfunction．Thistechniquehasbeenlabeledcellularcardiomyoplasty．Theaimofthisstudyistoexploreanexperimentalme