骨骼肌核质线粒体分离技术

《骨骼肌核质线粒体分离技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、骨骼肌组织分离细胞核、胞浆、线粒体150mg胫前肌组织，置于已预冷的玻璃培养皿，用剪刀剪碎。2剪碎的组织加入300-500uLSTMbuffer，于冰上研磨1min以使均质化（usingatight-fittingTeflonpestleattachétoapotterShomogenizersetto600-1000rpm），检查组织是否已均匀化，若否，重做均质化步骤。3均质化组织加入离心管，冰浴30min，最大速度离心15秒，4℃。然后800g离心15分钟。沉淀标志为P0，上清S0。沉淀P04沉淀P0为细胞核和细胞碎片残骸

2、。用300-500uLSTM溶液重悬，最大速度vortex15秒，500g离心15min。沉淀标为P1，上清S1弃去。此时可以用显微镜检测细胞核纯度：取P1少量溶于台盼蓝溶液，放入血球计数器（haemocytometer）显微镜下检测，若其中含有很多细胞碎片，则重复此步操作。5此步为提高P1的纯度：将步骤4沉淀重悬于300-500uL的STM溶液，最大速vortex15秒，然后1000g离心15min，沉淀标识为P5，上清S5弃去。6用200-500uL的NET重悬，用枪头吹打至均匀（usingapipettetotritur

3、ateuntilhomogeneous），最大速vortex15秒，置冰上30min，该组分即含有nuclei组分，超声（atahighsettingfor10-15swith30spauseswhilstbeingkeptonicethroughout.）9000g离心30分钟，4℃。上清S6即为nuclearfraction。上清S07S0：cytosolicandmitochondrialfractions。离心800g，10min，上清S2保留，沉淀P2可弃去亦可与P0合并。8S211000g10min离心，上清S3（

4、包含cytosolandmicrosomalfraction）用冷的纯（100%）丙酮在-20℃沉淀至少1小时后12000，5min。沉淀P7重悬于100-300ul的STMbuffer，标志为cytosolicfraction，其中可能包含一些微粒体（microsomalcontent）。9沉淀P3重悬于100-200uL的STM,11000g离心10分钟，沉淀P4为线粒体组分。该组分重悬于SOLbuffer，超声（athighsetingfor5-10secondswith30secondpauses）标志为mitocho

5、ndrialfraction。Buffers:STM:250mMsucrose50mMTris-HClpH7.45mMMgCl2ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsNETHEPESpH7.9MgCl20.5MEDTA0.2mMGlycerol20%Triton-X-1001%ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsSOLTrisHCl50mMpH6.8EDTA1mMTriton-X-1000.5%Proteaseandphosphatasein

6、hibitorcocktails文献：asimpleprotocolforthesubcellularfractionationofskeletalmusclecellsandtissue。