线粒体的分离与观察.doc

《线粒体的分离与观察.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实验八线粒体的分离与观察%1.教学目标：了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态，增加对线粒体的感性认识。掌握詹娜斯绿B染线粒体的方法。%1.重点：掌握用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。掌握詹娜斯绿B染线粒体的方法。U!%1.难点：蔗糖密度梯度离心加样操作技能。授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。五.教学内容：实验原理制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质屮进行差速离心。在一给定的离心场屮，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质屮离心一定

2、时间内，组织匀浆中的各种cell器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。细胞辭屮最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定稈度上能保持细胞器的结构和酶的活性。线粒体的鉴泄用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体cell色索氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质屮的染料被还原成无色。实验步骤1.匀浆:取lg肝细胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L缓冲蔗糖液匀浆（先加2nd匀浆，匀浆后再加7ml）,双层尼龙

3、布过滤于10ml试管屮备用。2.差速离心:取lml0.34mol缓冲蔗糖液于2nd刻度离心管中（用滴管加至lml刻度即可）,然后沿管壁小心加入肝匀浆,约0.5ml覆盖于上层,700Xg（3000rpm）离心10分钟，弃沉淀取上清液，lOOOOXg仃2000rpm）离心10分钟，沉淀为线粒体。3.染色：取线粒体沉淀涂片（注意勿A浓密），不待干即加1滴1%儈纳斯绿B染色15min04.观察：盖上盖玻片，显微镜观察。（线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。）实验结果线粒体蓝绿色,呈小棒状或亚铃:结果讨论六.课堂小结根据学生的实验结果进行总结。如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，

4、应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻,保持其生理活性。