线粒体分离及功能测定

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1、组织和线粒体裂解液（TissueandMitochondriallysisbuffer）：ComponentsFinalconcentrationTris-HCl50mMpH7.4NaCl150mMEDTA2mMEGTA2mMTritonX-1000.2%NP-400.3%PMSF100uMNaVO31mMNaF250mMLeupeptin10ug/mlAprotinin2ug/mlDTT1mM组织线粒体的分离1)小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓冲液中，2)充分洗去血水，尽量去除非组织成分，3)在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎，4)4℃，电动匀浆机，6

2、00rpm上下3次，5)1000g4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中，6)重复上面步骤一次，7)10,00Og4℃离心10min,沉淀即为线粒体，8)倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g洗一次，9)最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours），10)定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce匀浆法)低渗线粒体缓冲液（Hypotonicmitochondrialbuffer）:100mlComponentsFinalconcentrationHepes(KOH)20mMpH7.2Sucrose210mMMa

3、nnitol70mMEDTA1mMEGTA1mMMgCl21.5mMKCl10mMDTT1mM（注：用前加入蛋白抑制剂混合物，包括100uMPMSF等）收获细胞，PBS洗一次，转入1.5ml管中，加入适量低渗缓冲液，冰上浸泡约1hour,并不时混匀。然后用Dounce匀浆器手工匀浆，其间用台盼蓝检查细胞活性状况，至细胞破碎50%左右停止匀浆。3000rpm（约1000g）4℃离心10min,转移上清至新管中，继续12,000rpm离心15min，沉淀即为细胞线粒体。用提取缓冲液清洗一次，80℃冻存备用或直接裂解线粒体体外功能分析（1）线粒体耗氧测定：a)测定介质（Measuringbuffe

4、r）：225mM甘露醇，70mM蔗糖，1mMEDTA，0.1%BSA，10mM磷酸钾缓冲液，pH7.4。b)测定步骤：1)预热生物测氧仪并调节氧电极至需体积（2ml），测定温度为25℃。2)在反应槽中加入2ml纯水，使仪器稳定8～10mins，调节仪器最大相对氧浓度，然后加入少许保险粉，耗尽水溶液中的氧，调节仪器氧零值。3)清洗反应槽，然后加入反应介质，开始测定。介质体积＝反应总体积（2ml）－组织线粒体悬浮液体积。4)加入提取的线粒体悬液（一般组织线粒体约60ul，终浓度1mg/ml），记录一段时间基线后加入外源底物琥珀酸（2.5mM），出现IV态呼吸，记录约两分钟后，加入ADP（100m

5、M）3ul，出现III态呼吸，待ADP完全消耗后线粒体又恢复到IV态呼吸。5)线粒体呼吸控制率（RespiratoryControlRate,RCR），即加入ADP时（III态）的呼吸速率与ADP耗竭后（IV态）的呼吸速率之比，RCR反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。线粒体膜电位和ROS产生的测定：a)测定介质（PT-1buffer）：250mM蔗糖，10mMHepespH7.4，0.5mMKH2PO4，2uM鱼藤酮和4.2mM琥珀酸钾。b)测定方法：在石英杯中加入3ml反应介质，加入线粒体悬液（终浓度0.5mg/ml），然后加入罗丹明123（终浓度30nM），混匀后，于25℃孵育

6、5min后，开始实时监测荧光强度变化（激发波长520nm,发射波长527nm）。最后在反应体系中加入mCCCP(终浓度1uM)，以达到完全解偶联，使线粒体膜电位完全丧失，记录荧光强度的变化。该荧光强度变化反应线粒体膜电位的高低。测定线粒体ROS产生与测定膜电位的体系基本一致，不同是加入的荧光探针是CM-H2DCF（终浓度500nM），混匀后，同样孵育5min，开始实时检测荧光强度变化（激发波长500nm，发射波长520nm）。最后在反应体系中加入antimycinA(终浓度50uM)作为最大量ROS产生的对照。曲线的斜率即代表线粒体ROS产生的速率。组织ATP水平的测定按试剂盒说明书进行，具

7、体步骤如下：1)取小块组织（约50～100mg）放入玻璃匀浆器中，加入适当比例的裂解液（lysisbuffer），冰浴充分匀浆以确保组织完全裂解；2)裂解后，12,000rpm4℃离心10min，取上清，考蓝定量蛋白浓度，用于后续测定；3)取适当量的ATP检测试剂，按照1：100的比例用ATP检测稀释液稀释ATP检测试剂，配成ATP检测工作液，冰浴暂时保存；4)加100ulATP检测工作液到检测孔中（96孔板