免疫细胞的分离与功能测定

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1、免疫细胞的分离与功能测定一外周血单个核细胞的分离原理:密度梯度离心，利用密度为1.077±0.001g/L淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）主要步骤1无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml125～250U/ml肝素溶液）2用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4PBS稀释3按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液42000r/min水平离心30min，5吸取分层液与血浆交界部位的单

2、个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000r/min，1500r/min离心10min6用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞7台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。注意事项1严格无菌操作2操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀3淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用4如须保存血浆作他用，则不能稀释血液5离心最适温度18～20℃6分离组织中的单个核细胞也可采用上法二淋巴细胞的纯化㈠红细胞的去除1低渗裂

3、解法1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min）立即加入1.8﹪NaCl,洗涤2氯化铵处理法沉淀的PBMC中加入1ml0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2min，洗涤㈡血小板的去除1.PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板2.胎牛血清(FCS)梯度离心1mlPBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3mlFCS800r/min水平离心15min，18～20℃㈢单核细胞的去除1.粘附去除法原理单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml⑵将50ml细胞

4、悬液移入150cm2培养瓶，37℃5﹪CO295﹪湿度培养1h⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液⑷1300r/min离心10min，18～20℃⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性2.L-亮氨酸甲酯去除法溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯→L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞本法只适用于分离新鲜细胞⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol

5、/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min⑵1300r/min离心10min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度3.羰基铁吞噬离心法在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15min，然后用淋巴细胞分层液离心分离亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪三外周血淋巴细胞选择性分离㈠

6、T细胞的分离1.尼龙棉柱法原理B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/LHCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。尼龙棉柱制备塑料软管长12～16cm内经5～6mm壁厚0.2mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过20×106～30×106个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90﹪以上2.花环形成分离法原理T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细胞结合形成花环.绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果

7、和稳定性⑴1mlPBMC悬液(1×107/ml)、2mlNCS和1ml4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10min↓800r/min4℃离心5min，冰浴1h或800r/min室温离心10min，4℃2h↓置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液）↓1300r/min离心25min，18～20℃或2000r/min离心35min，4℃位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞⑵1mlPBMC悬液(1×107/ml)、2mlNCS和2ml2﹪N

8、M-SRBC悬液混匀，37℃水浴10min以下步骤同⑴经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞中，T细胞﹥95﹪，B细胞﹤1﹪，单核细胞约为2﹪。经2次花环形成试验后，非花环形成细胞中T细胞﹤2﹪用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些T细胞，导致功能增强㈡T细胞亚群的分离1.间接免疫吸附分离法原理T细胞+抗某种T细胞分化抗原的抗体↓加入包被有羊抗鼠Ig的平皿2.抗体/补体介导的细胞毒作用分离法原理是一种负性分离法T细胞+抗某种需去除T细胞分化抗原的抗体+