疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用

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1、第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用授课教师：程真珍学时数：2学时教学目的：熟练掌握免疫细胞的分离技术、细胞表面标志的检测和T细胞亚群、B细胞、NK细胞的检测，了解免疫细胞的功能检测和临床应用。教学要求1、掌握外周血单个核细胞的概念及其分离方法（Ficoll液分离法）2、掌握淋巴细胞表面标志的检测及亚群的分类。3、了解免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用。教学重点与难点重点：淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类难点：免疫细胞的分离第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T、B细胞和T细胞亚群的分离分离免疫细胞的样本来源外周血脾脏淋巴结胸腺骨髓分离免疫

2、细胞的目的检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的培养和建株细胞分离基本原理物理学和生物学特征密度大小表面标志其它活性：吞噬、黏附等一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090不同细胞密度不同聚蔗糖（Fic

3、oll）－泛影葡胺分层液法（一）原理和方法1.单次密度梯度分离法单次密度梯度连续密度梯度2.试剂：Ficoll－HypaqueFicoll：聚蔗糖，MW：40000，高密度，低渗透压、无毒性，6％Ficoll密度为1.020Hypaque：泛影葡糖胺，34％hypaque的密度为1.200，用于调整分离液的密度。分离人外周血单个核细胞用1.077±0.001的密度分离液。3.离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09)上层，经离心后细胞可分为不同的区带。4.收集细胞5.洗涤、计数密度梯度离心(Ficoll)离心（二）方法评价是分离PBMC最常用的方法

4、操作简单，不需特殊仪器设备分离纯度高，可达95％细胞得率高，可达80％二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）（去单核细胞）贴壁粘附法单核细胞－－贴壁生长玻璃、塑料平皿/培养瓶、37℃、1h取未贴壁细胞------淋巴细胞（T、B）刮下贴壁细胞------纯单核细胞缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率↓吸附柱过滤法层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中洗脱------淋巴细胞层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶粘附能力：Mф、Mon＞DC＞BC＞TC=RBCPercoll分层液法Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，

5、对细胞无毒、无刺激。Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。将PBMC加在分离液上低速离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞三T、B细胞和T细胞亚群的分离磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法磁性微球分离法原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。磁珠大小可以选择免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠细胞分选装置特点:简便,快速,费用低,无需特殊设备全自动细胞分选系统荧光激活细胞分离仪分

6、离法流式细胞分析仪第二节淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Clusterofdifferentiation，CD）。细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）辅助性T细胞Th1细胞CD3+

7、CD4+CD30-Th2细胞CD3+CD4+CD30+分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，辅助细胞免疫分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，辅助体液免疫参与迟发型超敏反应参与速发型超敏反应具有明显的细胞毒作用没有明显的细胞毒作用细胞毒性T细胞TC1:CD3+CD8+CD30-TC2:CD3+CD8+CD30+调节性T细胞自然存在的调节性T细胞CD4+CD25+Foxp3+诱导产生的调节性T细胞（Tr1和Tr3）二、B细胞表面标志SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，小鼠红细胞受体是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是