疫细胞的分离和功能检测

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1、第十章免疫细胞的分离和功能检测吴正吉副教授重庆医药高等专科学校医学技术系目　录1外周血单个核细胞的分离和纯化2淋巴细胞及其亚群的分离3吞噬细胞的分离和收集返回总目录免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来3免疫细胞种类﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞第一节吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的种类特征性标志CD14分离技术Pecoll密度梯度分离法流式细胞仪分离技术免疫磁珠分离法：为目前较常

2、用的方法黏附法一、吞噬细胞的分离（一）单核细胞的分离免疫磁珠分离法☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取（二）巨噬细胞的分离聚合物加速沉降法可从外周血中分离出白细胞RBC血浆(抗凝血)WBCRBCFicoll分离法可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞（三）中性粒细胞的分离Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。（一）中性粒细胞功能检测技术（二）巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测（一）中性粒细胞功能检测体内试验法：皮

3、肤窗法体外试验法：滤膜渗透法琼脂糖平板法趋化功能检测——检测细胞运动功能皮肤窗法在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。原理及技术要点在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。滤

4、膜渗透法原理及技术要点在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。趋化指数=A/B趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强琼脂糖平板法显微镜检查法吞噬指数=（一）中性粒细胞吞噬功能检测NBT还原试验原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲chan（紫黑色）杀菌功能检测方法：1.抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育25min。2.推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞率应≥95%NBT还原试验炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞

5、可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。（二）巨噬细胞功能检测Mф+CRBC孵育涂片、染色、镜检计算、吞噬率、吞噬指数吞噬率＝（吞噬CRBC的Mф数/计数的Mф数）×100％吞噬指数＝Mф吞噬的CRBC总数/计数的Mф数吞噬功能检测返回章目录PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离常用分层液：ficoll－hypaque，percoll第二节外周血单个核细胞的分离和纯化细胞比重血小板1.030~1

6、.035PBMC1.075~1.090多核白细胞1.092红细胞1.093外周血各细胞成分的密度Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。原理：Ficoll分层液：密度1.077±0.001离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布一、Ficoll分离法Ficoll分层液分离单个核细胞示意图78％98％Percoll分离单个核细胞示意图返回章目录﹡红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法﹡血小板的去除：胎牛血清梯度离心法﹡单核细胞的去除：黏附法羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）苯丙氨酸甲酯去除法第三节淋巴细胞及其亚群的分离一、淋巴细胞

7、的纯化免疫磁珠分离法流式细胞术分离法其他方法二、淋巴细胞亚群的分离原理将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（IMB），当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将IMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法488nm激光+-前向散射光检测器荧光检测器电磁场单个细胞被分类进入检测管流式细胞术分离原理示意图E花环沉降法T细胞功能检测B细胞功能检测NK细胞功能检测三、相