淋巴细胞的分离和功能检测

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1、淋巴细胞的分离和功能检测SeparationandAssaysforLymphocytes第一节外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclercell，PBMC):单核细胞淋巴细胞人不同细胞的漂浮密度红细胞：1.09~1.1嗜酸性：1.09~1.095嗜中性：1.080~1.085B细胞：1.062~1.075T细胞：1.065~1.077NK：1.050~1.070单核细胞：1.050~1.066血小板：1.030~1.060Ficoll分层液分离法属于单次密度梯度离心分离法分离液组成：聚蔗糖（商品名为Ficoll）泛影葡

2、胺（常用商品为isopaque、hypaque）故又称Ficoll-hypaque分层液Ficoll：分子量：40KD高密度低渗透压无毒性使用浓度：60g/L(密度：1.020）泛影葡胺：使用浓度：340g/L（密度：1.200）Ficoll-hypaque的密度：分离人外周淋巴细胞：1.077±0.001分离小鼠淋巴细胞：1.088分离马淋巴细胞：1.090操作过程：将抗凝全血以Hank’s液适当稀释后轻轻叠加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4℃~8℃或冰浴）。水平式离心（2000rpm，20min）吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用密度梯度分离单个核细胞（F

3、icoll分层液）细胞活性：＞95%单个核细胞纯度：＞95%细胞获得率：＞80%最佳温度：20℃Percoll分离法属于连续密度梯度离心分离法Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒特点：渗透压低、黏度小、无毒扩散常数低，可形成稳定的梯度操作：Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲液高速离心，使分层液形成连续密度梯度将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得到四个细胞层吸取所需细胞层，洗涤备用密度梯度分离单个核细胞（Percoll分层液）细胞活性：＞95%细胞纯度：＞98%细胞获得率：＞75%最佳温度：20℃密度梯度离心法注意事项：无菌操作安全防护注意最佳温度操

4、作适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍，但要收集血浆成分则不能稀释）第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化外周血单个核细胞中还含有少量单核细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若特定试验要求应该除去这些成分.红细胞去除法低渗裂解法PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。氯化铵处理法PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞血小板去除法离心洗涤法HBSS或PBS洗涤分离的PBMC2-3次，可去除大部分血小板。单核细胞去除法粘附法单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面，淋巴细胞则不

5、能，将PBMC置于细胞培养瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。淋巴细胞纯度：＞95%活性：＞95%L-亮氨酸甲酯法L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成有毒L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。淋巴细胞纯度：＞99%活性：＞95%羰基铁吞噬法单核细胞可吞噬羰基铁粉，吞噬后的细胞比重增大，分层液密度梯度离心时沉淀于管底。免疫磁珠法利用抗体致敏的磁珠与细胞结合，让细胞通过磁细胞分选仪，分离具有特异标记的免疫细胞。第三节外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分离及纯化T细胞及其亚群的选择性分离尼龙棉柱分离法利用B细胞和单核细胞易于粘附于尼龙纤维表

6、面的特性，可将T和B细胞分离操作：将尼龙毛（聚酰胺纤维）填充于5-6mm内径的塑料管中，单个核细胞悬液加入，37℃1-2小时，10%-20%FCS灌洗，收集洗脱液。回收率：20%~30%T细胞纯度：＞90%一般不用于分离B细胞花环形成法-E花环成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体（CD2),可与绵羊红细胞结合形成花环，经Ficoll密度梯度离心，再经裂解即可获得T细胞。T细胞回收率差异大T细胞纯度：＞95%分离过程可能激活某些T细胞免疫磁珠分离法将抗体与磁性微珠结合形成免疫磁珠（immmunomagneticbeads，IMB),免疫磁珠与细胞结合后，在外加磁场的作

7、用下，免疫磁珠-细胞复合物被吸附，从而起到分离的作用。单克隆抗体-磁珠分离系统（monoclonalantibody-magneticcellsorting，MACS)阳性分离：获得被吸附的细胞阴性分离：获取非吸附细胞分离纯度：80%~99%得率：60%~90%，仅次于流式细胞仪CD4+T细胞流式细胞仪分选法流式细胞术（flowcytometry，FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的分析和分选技术流式细胞仪流动室和液流系统激光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统细胞纯度：＞99%细胞得率：＞90%细胞活性：＞95%B