[精品]淋巴细胞的分离技术.doc

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1、淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1•淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖一泛影葡胺液:聚蔗糖（polysucrosesolution），商品名Ficoll,分子量400000,多配制成40±1%（W/V）水溶液，也有干粉出伟。应用时，用蒸憎水配制9%溶液。泛影葡胺溶液（Megluminidiatrizoici）,商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1一去氧一甲氨基山梨醉。含量为60%或75%,毎安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸

2、憎水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。1.077±0.001聚蔗糖一泛影匍胺的配制：9%聚蔗糖液24份33.9%泛影葡胺液10份混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用G：,漏斗过滤除菌或114.3°C高压灭菌15min,4°C保存。一般可保存3个月。如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中dm为分层液的比重,山和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重，V】和W分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖一泛影葡胺的分层液，则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100:46.

3、3o（2）泛影葡胺一右旋糖酹（dextran）液34%泛影葡胺液10份60%右旋糖酊诫12.5份混合，即为比重1.07〜1.09的分层液。分装于棕色瓶屮，4°C冰箱保存备用。2.3%的明胶液称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水，终体积100ml,114.3°C高压灭菌lOmin,冷却后4°C冰箱保存，临用时37°C预热10min。3.Hank's液。（二）操作方法1.取抗凝血，B然沉降，如是马属动物的血液，可岚接直立试管架上，让其白然沉降lh,取上层血浆。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3%明

4、胶液，混匀后让其白然沉降，lh后取上层血浆。2.2000r/min离心10min,弃上清。3.沉淀用Hank's液混悬后,再2000r/min离心lOmirio4.重复步骤3—次，再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群，包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。1.取2ml细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆（白然沉降lh的上层血浆）轻轻加入分层液上，岚接加抗凝血也可。2.以水平转子离心机2OOOr/min离心20mino离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,

5、屮间层是分层液，最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的H色层，即为单个核细胞层。3.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管屮。4.以Hank's液洗涤、离心，最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。（三）注意事项1.血浆或血液加入分层液屮时要小心，缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的，所以一般情况下，是现采血，马上进行分离。3.经过分层液分离的淋巴细胞层，实际上是单个核细胞层，包括单核细胞，不包括粒细胞。欲分离岀纯的淋巴细胞，

6、则按下法除去单核细胞，或收获单核细胞。